wydział BiNOŻ

kierunek: Biotechnologia

semestr: 4

zajęcia: wtorek 1215-1600

data oddania sprawozdania:

                                                   Laboratorium z Biochemii

                                                                      Ćwiczenie 1

                                                                      Aminokwasy

                                                                                                                                            Joanna Ksiądzyna

                                                                                                                                            Ewa Świegocka

                                                                                                                                Honorata Karasińska

AMINOKWASY

Wstęp teoretyczny

Aminokwasy są pochodnymi kwasów karboksylowych, jednocześnie możemy zaliczyć je do biopolimerów. W przyrodzie występuje ok 1500 aminokwasów z tym, że białka tworzy 20 +1 aminokwasów i są to aminokwasy szeregu L o konformacji α. Aminokwasy nieproteinogenne np. D-aminokwasy występują w antybiotykach produkowanych przez drobnoustroje. Właściwości aminokwasów wynikają z obecności dwóch grup tj. karboksylowej oraz aminowej. Większość aminokwasów kodowanych jest przez trójki nukleotydów-kodony, cześć powstaje przez transformacje potranslacyjne. Wszystkie aminokwasy oprócz glicyny są czynne optycznie; posiadają tetraedryczne (chiralne) atomy węgla.

Aminokwasy występują w 99% w formie zjonizowanej i mają charakter amfoteryczny. W zależności od  pH środowiska w stosunku do pI zachowują się w następujący sposób.

jeżeli :

pH < pI aminokwas tworzy kation – jest słabym kwasem

pH=pI aminokwas przybiera formę amfijonu, w tym pH aminokwas ma szczególne własności-najsłabiej przewodzi prąd i jest najtrudniej rozpuszczalny

pH>pI tworzy anion i zachowuje się jak słaba zasada

Podział aminokwasów:

-obojętne ( Glicyna, Alanina, Walina, Leucyna, Izoleucyna, Asparagina, Glutamina)

-kwaśne( Asparaginian, Glutaminian)

-zasadowe(Lizyna, Arginina, Histydyna)

-z pierścieniem aromatycznym( Fenyloalanina, Tyrozyna, Tryptofan)

-zawierające grupę -OH ( Seryna, Treonina)

-grupa aminowa jest drugorzędowa i jest częścią pierścienia-Prolina

-zawierające siarkę( Cysteina, Metionina)

+Selenocysteina

Podział aminokwasów według charakteru reszty R

- aminokwasy z apolarną resztą R(Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Met)

- aminokwasy z polarna, ale niejonizującą lub bardzo trudno jonizującą resztą R(Ser, Thr, Tyr, Trp, Cys, Asn, Gln)

-aminokwasy zawierające w reszcie R dodatkową grupę karboksylową(Asp, Glu)

-aminokwasy zawierające dodatkową grupę – NH2 (His, Lys, Arg)

Aminokwasy ulegają reakcji kondensacji tworząc dimery, oligomery, peptydy i białka. Łączą się one wiązaniami  peptydowymi zwanymi inaczej  amidowymi, kowalencyjnymi. Wiązanie peptydowe

jest bardzo trwałe-porównywalne jest do wiązania zdelokalizowanego.

Pomiędzy cysteinami mogą tworzyć się wiązania (mostki) disiarczkowe tworząc cystynę. Występowania mostków w białku między innymi determinuje budowę przestrzenną białka.

Pochodne aminokwasów powstające między innymi w wyniku dekarboksylacji, czy alkilowania aminokwasów, niejednokrotnie pełnia bardzo ważne funkcje biologiczne bez których organizmy nie mogłyby funkcjonować.

W organizmie zwierząt wyższych i człowieka niektóre aminokwasy białkowe są endogenne (syntetyzowane w organizmie) inne egzogenne.

Aminokwasy egzogenne nie mogą być syntetyzowane w organizmie człowieka i zwierząt wyższych, dlatego muszą być dostarczane z zewnątrz wraz z pokarmem białkowym. Należą do nich leucyna, izoleucyna, lizyna, fenyloalanina, metionina, walina, treonina, tryptofan, histydyna i arginina. Arginina wprawdzie powstaje w cyklu mocznikowym, ale po odszczepieniu od niej cząsteczki mocznika przekształcana jest w ornitynę– aminokwas niewykorzystywany do syntezy białek.

Prawidłowy wzrost dzieci wymaga dostarczania argininy z zewnątrz, ponieważ jej ilości powstające w cyklu mocznikowym są niewystarczające. Dla ludzi dorosłych wystarczające mogą być ilości argininy powstające w cyklu mocznikowym. Największe dzienne zapotrzebowanie człowieka dorosłego jest na leucynę, a najmniejsze na tryptofan.

Pozostałe aminokwasy białkowe należą do endogennych, ponieważ są syntetyzowane w organizmie zwierząt wyższych i człowieka. Wśród nich są tzw. względnie endogenne, które mogą być

syntetyzowane w organizmie tylko pod warunkiem dostarczenia ich egzogennego prekursora,

z którego powstają. Tyrozyna jest takim aminokwasem endogennym, powstającym w organizmie z egzogennej fenyloalaniny. Jeśli jednak nie zostanie dostarczone pożywienie, które zawiera odpowiednie ilości fenyloalaniny, nastąpi w organizmie deficyt tyrozyny (której obecność w pożywieniu nie jest konieczna). Podobnie (lecz w mniejszym stopniu) może być z cysteiną, która powstaje z egzogennej metioniny, lecz również z endogennej seryny. W przypadku braku nawet jednego aminokwasu, w organizmie zaczynają przeważać procesy rozkładu białek nad ich syntezą, czego konsekwencją jest ujemny bilans azotu.

Wykonanie ćwiczenia

2.1. Amfoteryczne właściwości aminokwasów
Zjawisko amfoteryczności można obserwować, zmieniając pH roztworu aminokwasu. Doświadczenie wykonać dla-roztworu L- tyrozyny; punkt izoelektryczny tego aminokwasu występuje przy pH 5,7.

Materiały i sposób wykonania doświadczenia:

·         stały preparat L- tyrozyny

·         0,1M roztwór kwasu solnego

·         0,05M roztwór wodorotlenku sodu

Szczyptę krystalicznej L- tyrozyny rozpuszczono na ciepło, w łaźni wodnej, w kilkunastu (10-15) kroplach roztworu HCl. Po czym dodano ostrożnie, kropla po kropli, roztwór NaOH, aż do momentu powstania wyraźnego osadu. Następnie próbę zalkalizowano, używając mocniejszego roztworu zasady.

Przy pH równym punktowi izoelektrycznemu aminokwas przybiera formę amfijonu, w tym pH aminokwas ma szczególne własności-najsłabiej przewodzi prąd i jest najtrudniej rozpuszczalny. Natomiast kation (pH mniejsze od punktu izoelektrycznego) oraz anion (pH większe od punktu izoelektrycznego) są lepiej rozpuszczalne.

Metody oznaczania aminokwasów
Stosowane w analityce aminokwasów metody mają charakter oznaczeń ogólnych, pozwalających badać prawie wszystkie aminokwasy lub wybiórczych, odnoszących się tylko do niektórych aminokwasów.

2.2.1. Metody ogólne
Podstawą metod ogólnych są reakcje, w których biorą udział wspólne dla wszystkich aminokwasów grupy chemiczne, czyli: aminowa lub karboksylowa.

2.2.1.1. Odczyn ninhydrynowy
Istotą oznaczenia jest złożona reakcja aminokwasów z ninhydryną, przebiegająca
w temperaturze 100°C, obejmująca dwa zasadnicze etapy. W pierwszym stadium pod wpływem ninhydryny cząsteczka aminokwasu ulega utlenieniu oraz przemianie do uboższego o jeden atom węgla aldehydu. Wydziela się wówczas amoniak i dwutlenek węgla. Następnie w wyniku kondensacji, za pośrednictwem uwolnionej z aminokwasu cząsteczki amoniaku, cząsteczek: zredukowanej (1. etap) i utlenionej ninhydryny powstaje barwny kompleks. Intensywność zabarwienia próby jest wprost proporcjonalna do ilości uwolnionego amoniaku, a w konsekwencji do zawartości aminokwasu w próbie. Uproszczony zapis przebiegu reakcji ilustruje przedstawione poniżej równanie chemiczne.

Reakcji tej ulegają jedynie aminokwasy z wolną grupą α aminową, czyli wszystkie
(z wyjątkiem proliny) aminokwasy proteinogenne. Metoda ninhydynowa, ze względu na czułość i dokładność, jest oznaczeniem najczęściej stosowanym: zarówno w jakościowej, jak
i ilościowej analizie aminokwasów.

(!) Oprócz aminokwasów, peptydów i białek dodatni odczyn ninhydrynowy dają: sole amonowch, aminocukry i amoniak

Materiały i sposób wykonania doświadczenia:

·         0,5% roztwór glicyny

·         0,5% roztwór histydyny

·         Roztwór białka jaja kurzego

·         1% acetonowy roztwór ninhydryny (odczynnik ninhydrynowy)

Do 0,5 ml roztworu badanego aminokwasu dodano taką samą objętość odczynnika ninhydrynowego. Przygotowaną mieszaninę ogrzewano 15 min. w l00°C (we wrzącej łaźni wodnej). Równolegle wykonano próbę odczynnikową, zawierającą zamiast aminokwasu wodę.

Tabela 1. Podsumowanie reakcji ninhydrynowej

2.2.1.2. Reakcja z kwasem azotawym (wg. Van Slyke’a)

Kwas azotawy wywołuje deanimację aminokwasów z wydzieleniem stechiometrycznej ilości gazowego azotu, zgodnie z reakcją:

Materiały i sposób wykonania doświadczenia:

·         5% roztwór azotynu sodowego

·  ...