Enzymologia- wykłady 2010
MODYFIKACJE ENZYMATYCZNE SKŁADNIKÓW ŻYWNOŚCI- BIAŁKA (VIII)
HYDROLIZA
Jest podstawową modyfikacją enz. białek, znajdującą szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym. Białka [w.m.cz.>10 000(>100 aminokwasów)]przy użyciu całej gamy enz. proteolitycznych, różniących się specyficznością, mogą być hydrolizowane do peptydów i aminokwasów. Modyfikacje te wykorzystuje się do otrzymywania licznych produktów o charakterystycznych właściwościach funkcjonalnych, które w dużym stopniu uzależnione są od:
¨ Specyficzności enzymu i
¨ Stopnia hydrolizy.
OGRANICZONA PROTEOLIZA
Prowadzona przy użyciu enzymów charakteryzujących się dużą specyficznością, znalazła liczne zastosowania do modyfikacji struktury białek w przem. spożywczym.
Najważniejsze- przy wstępnym etapie produkcji serów podpuszczkowych z kazeiny mleka, gdzie w wyniku hydrolizy wiązania Phe-Met w części C-końcowej kazeiny-k ulegają destabilizacji micele kazeinowe. Odłączenie końcowych peptydów lub glikopeptydów od micelarnej kazeiny-k powoduje dalej idące zmiany struktury i wpływa na oddziaływania mieli parakazeiny pomiędzy sobą i jonami wapnia znajdującymi się w środowisku.
Prowadzi to do agregacji i żelifikacji- mówimy wówczas o powstawaniu skrzepu lub koagulacji mleka. Dalsze modyfikacje białka w uzyskanym skrzepie prowadzone są przy udziale aparatu enzymatycznego drobnoustrojów wprowadzanych w postaci kultur serowarskich.
O optymalnych właściwościach strukturalnych i smakowo- zapachowych decyduje:
o Specyficznośćenzymów oraz
o Stopień proteolizy i peptydolizy.
Ważna jest równowaga pomiędzy aktywnością proteolityczną i peptydolityczną, aby nie doszło do akumulacji gorzkich peptydów, charakteryzujących się dużą zawartością hydrofobowych aminokwasów (Phe, Leu, Tyr).
Ograniczona proteoliza wykorzystywana jest również do modyfikacji glutenu (mąka).
Hydroliza części wiązań peptydowych (proteinaza z Aspergillus oryzae) w ściśle upakowanej wiązaniami disiarczkowymi, strukturze IV rz. wpływa na:
§ Zmianę właściwości elastycznych i
§ Sprężystych ciasta (chrupkość, pulchność) oraz
§ Skrócenie czasu mieszania
Dodatkowym aspektem jest w tym przypadku rozkład inhibitorów amylaz pszenicy.
Modyfikacja enzymatyczna białek mięsa ma miejsce w procesie tenderyzacji. Stosuje się dodatek roślinnych proteinaz (papaina, oficyna, bromelaina), które wspomagają prowadzony przez enzymy endogenne proces proteolizy makrocząsteczek białka włókien mięśniowych. Prowadzi to do:
¨ Rozluźnienia tkanki mięśniowej w wyniku częściowej hydrolizy białek miofibryli i
¨ Nieco głębszej hydrolizy białek sarkoplazmy. Wpływa
Wpływa to na wzrost ich rozpuszczalności (głębsza proteoliza prowadzi do powstania niewielkich peptydów peptydów wolnych aminokwasów wzbogacających smak).
Ograniczona proteoliza wykorzystywana jest także przy otrzymywaniu hydrolizatów zawierających polipeptydy stosowane w celu poprawy właściwości
· Pianotwórczych i
· Emulgujących.
Ich właściwości powierzchniowo-czynne wynikają z obecności domen hydrofilowych i hydrofobowych w łańcuchu polipeptydowym.
OTRZYMYWANIE BIOAKTYWNYCH PEPTYDÓW
Specyficzność enz. proteolitycznych wykorzystywana jest przy otrzymywaniu bioaktywnych peptydów, charakteryzujących się ściśle sprecyzowanymi właściwościami. Otrzymano peptydy analogiczne do uwalnianych w przewodzie pokarmowym człowieka. Stwierdzono, że ich aktywność nie ogranicza się jedynie do miejsc, w których są uwalniane, ponieważ mogą być transportowane poprzez nabłonek jelita i krew do innych organów oraz do systemu immunologicznego.
Zbadano peptydy wykazujące różnorodne aktywności i stwierdzono ich wpływ m.in. na:
¨ Funkcjonowanie przewodu pokarmowego,
¨ Przepływ krwi,
¨ Nadciśnienie
Stwierdzono, że mogą działać jako:
§ Immunoregulatory
§ Czynniki wzrostu mikroorganizmów probiotycznych
§ Wspomagać proces wiązania Ca i innych pierwiastkw.
Potencjalne możliwości zastosowania całej gamy bioaktywnych peptydów otrzymanych z różnych białek przy wykorzystaniu specyficzności enz. proteolitycznych, wydają się być duże, jednak proces wymaga szczegółowych badań nie tylko funkcjonalnych ale także immunochemicznych, cytochemicznych i klinicznych.
Hydroliza białek do małych peptydów i aminokwasów
Hydroliza białek przy udziale mało specyficznych enzymów proteolitycznych wykorzystywana jest do produkcji hydrolizatów smakowych. Uzyskuje się w ten sposób:
§ małe peptydy i wzbogacające smak art. spożywczych
§ aminokwasy
np. przy zastosowaniu alkalozy odzyskuje się z resztek mięsa rozpuszczalne peptydy wzbogacające smak zup i konserw.
Hydroliza białek do małych rozpuszczalnych peptydów i aminokwasów stosowane jest także w browarnictwie w celu zapobiegania zmętnienia piwa.
Całkowita hydroliza białka- otrzymywanie aminokwasów
Aby całkowicie zhydrolizować wybrane (kryterium stanowi zawartość pożądanych aminokwasów) białko konieczne jest użycie kilku enzymów proteolitycznych o różnej specyficzności. Najczęściej stosuje się:
· pepsynę
· trypsynę
· papainę
· dipeptydazę prolinową
· aminopeptydazę leucynową.
Często wykorzystuje się nieczyszczone preparaty enzymatyczne, np. wyciąg z trzustki przy otrzymywaniu Glu i Asp.
ASP procesach należy uwzględnić optimum pH poszczególnych enzymów, np. inkubacja z pepsyną przy pH 2, zmiana pH do alkalicznego i inkubacja z trypsyną. Po hydrolizie do rozdziału aminokwasów stosuje się metody chromatograficzne.
Plasteinowanie
Wykorzystując enz. proteolityczne można otrzymać generację nowych, w tym również funkcjonalnych peptydów. Dotychczas prowadzone badania wskazują na 2 mechanizmy syntezy- transpeptydację i kondensację.
Reakcja transpeptydacji (c) polega na substytucji kowalencyjnie związanego fragmentu peptydowego innym. W przeciwieństwie do tego co mam miejsce podczas hydrolizy enzymatycznej (a), jako nukleofil zamiast H2O reaguje wolna grupa –NH2 drugiego peptydu.
Natomiast reakcja kondensacji (b) jest niejako odwróceniem reakcji hydrolizy (utworzenie peptydyloenzymu i przeniesienie grupy peptydowej na atom nukleofilowy azotu N-końcowej grupy innego peptydu (Rys.1.))
Modyfikacje tego typu prowadzone są przy udziale papainy w hydrolizatach pozyskiwanych przy wykorzystaniu proteina grzybowych, pepsyny, cymotrypsyny [w m.cz. peptydów 450-1500]. Ich celem jest wbudowanie do łańcuch peptydowego domen zawierających aminokwasy:
§ zwiększające rozpuszczalność (np. Glu- wzrost rozpuszczalności białek soi, hydrolizatów białek ryb),
§ podnoszące wartość żywieniową (np. wzbogacenie białek soi w Met, glutenu w Lys).
Sieciowanie
Polega na tworzeniu wewnątrz i międzycząsteczkowych wiązań poprzecznych pomiędzy łańcuchami polipeptydowymi białek, np. w:
¨ kazienie,
¨ laktoglobulinie,
¨ glutenie,
¨ białkach soi.
Najczęściej wykorzystywana jest do tego celu reakcja przenoszenie reszt arylowych, których donorem są grupy karboksylowe lub karboksyamidowe reszt kwasu glutaminowego lub glutaminy w łańcuchach polipeptydowych białek.
Stosuje się enzym:
§ g- glutamylotransferazę glutaminylopeptydową [EC 2.3.2.13]
§ lub g- glutamylotransferazę [EC 2.3.2.2]. Stosowana nazwa transglutaminaza jest niepoprawna.
Białko-(CH2)2CONH2 + NH2(CH2)4- Białko [EC 2.3.2.13]
Białko- (CH2)2-CO-NH- (CH2)4- Białko + NH3
Zmiana struktury białka wpływa na jego:
® rozpuszczalność,
® zdolność wiązania wody,
® elastyczność i
® sprężystość
Akceptorem acylu białek lub peptydów zawierających reszty Gln lub Glu mogą być także I- rzędowe grupy aminowe innych związków, np. amin lub aminokwasów H2N-R. Za pomocą tej reakcji enzymatycznej można więc przyłączyć do białka odpowiednie grupy R wpływając na zmianę jego ładunku i/lub właściwości (kowalencyjne wiązanie aminokwasów niezbędnych). Najlepszym akceptorem amin jest gluten, zawierający dużo Glu i Gln.
Omówione modyfikacje znalazły zastosowanie:
¨ w przemyśle mięsnym (hamburgery, kotlety, farsze, konserwy),
¨ w przemyśle rybnym (poprawa konsystencji i wyglądu past),
¨ w przemyśle mleczarskim (substytuty tłuszczu, poprawa cech organoleptycznych jogurtów i kremów, jadalne powłoki ochronne),
¨ w przemyśle owocowo-warzywne (modyfikacje białek roślinnych, imitacje, żele, powłoki ochronne),
¨ w piekarnictwie (poprawa sprężystości pieczywa).
E, H2O2
Reakcje sieciowania białek może mieć miejsce również podczas działania peroksydazy, w obecności H2O2, na reszty Tyr.
Białko—CH2-- o –OH + HO—o --CH2—Białko
HO—o –CH2—Białko
+ 2 H2O
Białko—CH2—o –OH
Defosforylacja i fosforyzacja białek
Odłączenie reszt fosforanowych od reszt fosfoprotein lub fosfopeptydów wpływa na zwiększenie ich rozpuszczalności w obecności jonów wapnia. Reakcje katalizują fosfatazy:
· kwaśna [EC 3.1.3.2] i
· alkaliczna [EC 3.1.3.1].
które hydrolizują estry fosforanowe niezależnie od rodzaju związanego z kwasem alkoholu (w białkach najczęściej grupy –OH Ser).
fosfataza
O
H2O
Białka—CH2—O—P—OH Białko—CH2OH + H3PO4
OH
Fosforyzacja białek wpływa:
§ na poprawę ich właściwości emulgujących i
§ wzrost objętości piany (ale zmniejsza jej stabilość).
Reakcję można przeprowadzić przy udziale kinaz białkowych [EC 2.7.1.37] występujących w soi, zbożach, ryżu. Niezbędnym kosubstratem jest ATP (drogi).
KINAZA
Białko—OH + ATP Białko—O—P—OH + ADP
Deaminacja
Wpływa na:
¨ poprawę rozpuszczalności,
¨ zdolności spieniania i
¨ emulgowania.
Proces dotyczy głównie hydrolizy reszty amidowej Gln w peptydach i hydrolizatach białek przy udziale peptydyloglutaminazy z Bacillus cereus [EC 3.5.1.4]. enzym ten charakteryzuje się ograniczoną aktywnością wobec białek,
EC 3.5.1.4, H2O
-- CH2—C—NH2 -- CH2COOH + NH3
Przemiany oksydo-redukcyjne białek i aminokwasów
Obecność w środowisku takich enz. jak:
· reduktaza cystynowa [NADH, EC 1.6.4.1],
· disulfido-reduktaza białek [NAD(P)H, EC 1.6.6.4],
· disulfido-reduktaza białek [przeniesienie na glutation EC 1.8.4.2],
· dioksygenaza cysternowa [EC 1.13.11.20]
W odpowiednich warunkach, może prowadzić do rozerwania mostków disiarczkowych utworzonych przez reszty Cys.
Białko—CH2—S—S—CH2--Białko→Białko—CH2—SH + HS—CH2—Białko
Oksydoreduktazy modyfikują także reszty fenolowe Tyr
beeola