Modyfikacje genetyczne
Znajomość różnicy strukturalnych pomiędzy enzymami katalizującymi te same przemiany w ekstremalnie różnych warunkach może umożliwić projektowanie biokatalizatorów przystosowanych do optymalnych parametrów procesu technologicznego.
Do rozwoju tego typu badań przyczyniła się analiza porównawcza tych samych enzymów wyizolowanych z drobnoustrojów bytujących w ekstremalnie różnych biotopach.
Okazało, się że ich adaptacja wynika z:
- ograniczonych zmian w składzie aminokwasów, które mają wpływ na wzrost lub spadek oddziaływań niekowalencyjnych, takich jak:
· Hydrofobowe
· Jonowe
· Wodorowe
Przy czym reszty aminokwasów katalitycznych i wiążących substrat są takie same.
Ponadto lub taka sama jest również struktura kieszeni katalitycznych.
Modyfikacja nie dotyczy również
Molekularnych mechanizmów. Które są wspólne dla biokatalizatorów działających In vivo w różnych środowiskach. Jej celem jest przezwyciężenie.
związanych z niską temperaturą, niekorzystnych dla przebiegu reakcji enzymatycznej zjawisk takich jak:
- wzrost lepkości środowiska reakcji
- zmniejszenie szybkości dyfuzji i
- spowolnienie przebiegu reakcji
(wiązanie substratu, tworzenie i rozpad kompleksu ES)
lub związanego z wysoką temperaturą braku stabilności.
Zaobserwowano następujące zmiany w strukturze I-rzędowej:
- podstawienie Pro resztą Phe (zwiększa gęstość pętli, a niska zawartość Pro jest cechą charakterystyczną enzymów pochodzących z biotopów zimnych np. lipaza – 40 % mniej Pro w porównaniu do mezofili)
- wyższa zawartość Gly ( występujący w niej zamiast węgla atom H nie przeciwdziała odkształceniom α-heliksu, zaobserwowane nagromadzenie Gly w pobliżu centrum aktywnego enzymów „zimnych” zapewnia wzrost liczby stopni swobody).
- obniżona zawartość aminokwasów zasadowych Arg lub Arg+Lys ( zapewnia wzrost giętkości łańcucha poprzez zmniejszenie liczby wiązań elektrostatycznych z aminokwasami kwaśnymi, np. amylaza antarktyczna 13 Arg, a trzustkowa 29).
-mniejsza zawartość reszt hydrofobowych ( mniejsza siła oddziaływań hydrofobowych, wpływająca na bardziej luźną strukturę, np. lipaza antarktyczna 19 reszt polarnych, a mezofilna 40).
- więcej aminokwasów kwaśnych na powierzchni cząsteczki (większa hydrofilowość powierzchniowa – oddziaływania z polarnym rozpuszczalnikiem).
-mniejsza liczba mostków solnych, które usztywniają strukturę ( amylaza antarktyczna7, a trzustkowa 19).
Kinetyczne właściwości takich enzymów, takie jak:
- wysoka aktywność i
- skuteczność katalityczna w niskich temperaturach oraz
- ich termolabilność mają ogromne znaczenie w praktyce.
Obniżenie temperatury procesu wpływa na:
- zmniejszenie ryzyka zakażeń mezofilami
- obniżenie kosztów (energia)
- skrócenie czasu i obniżenie temperatury inaktywacji enzymu
- możliwość zastosowania selektywnej inaktywacji w mieszaninie enzymów
- poprawę jakości produktu.
W praktyce stosowane lipazy aktywne w 10ºC, trwają prace nad adaptacją
- oksydazy glukozowej,
- enzymów do produkcji lotnych związków organicznych
- ß- galaktozydazy ( enzym z mezofili – hydroliza w 30-40ºC trwa 4h, a w 5-10ºC 24 h)
Enzymy termostabilne wykazują maksymalną aktywność nawet w temperaturach powyżej 100C. stwierdzono, że wzrost termostabilności zapewniły mutacje ograniczające swobodę zmian konformacyjnych.
W enzymach drobnoustrojów termofilnych i hipertermofilnych podstawienia aminokwasów mają charakter odwrotny w porównaniu do psychotrofów.
Wzrost stabilności cząsteczki zapewnia zamiana Gly na Alg ( reszta CH3 - nie odkształca sąsiednich fragmentów łańcuchu, zapewnia większą stabilność struktury niż atom H w Gly.
W największym stopniu przyrost termostabilności zapewnia Pro.
- której pierścienie usztywniają wiązania peptydowe i
- ograniczają stopień swobody grup sąsiednich.
Ważny jest udział i rozmieszczenie domen hydrofobowych.
( na powierzchni cząsteczki zmniejszają stabilność, a w jej wnętrzu, gdzie tworzą ściśle upakowany rdzeń o niewielkim stopniu swobody są mało podatne na siły entropii środowiska o wyższej temperaturze).
Zjonizowane grupy funkcyjne stabilizują cząsteczkę tylko wtedy gdy mają przeciwne ładunki (ładunki jednoimienne zmniejszają stabilność). Wyjątkiem jest sytuacja gty tworzą mostki solne z udziałem Ca, Mg lub innych wielowartościowych kationów ( usunięcie kationów chelatorami zmniejsza stabilność).
W adaptacjach najczęściej obserwuje się usunięcie oddziaływań jonowych o destabilizującym działaniu, a nie tworzenie nowych, wpływających na stabilizację.
W związku z ograniczeniem swobody zmian konformacyjnych enzymy termostabilne w warunkach optymalnych dla mezofili osiągają tylko niewielki procent tej aktywności ktorą wykazują wysokich temperaturach. Hodowlę hipertermofili utrudniają niepożądane metabolity i wysoka T rozwoju (Pyrolobus fumaris - 120ºC pod zwiększonym ciśnieniem).
MODYFILACJE NIEKOWALENCYJNE ENZYMÓW (III)
Enzymy posiadają ściśle określoną, wysoce uporządkowaną strukturę przestrzenną, czyli konformację,
· warunkującą ich działanie biologiczne oraz,
· określoną plastyczność niezbędną do tego działania.
Uszkodzenie tej struktury i przekształcenie jej w strukturę mniej uporządkowaną określa się mianem denaturacji. Może być ona odwracalna lub nieodwracalna. Proces odwrotny do denaturacji nazywamy renaturyzacją.
Denaturacja jest najczęstszą przyczyną utraty właściwości katalitycznych enzymów, czyli ich inaktywacji (powodem inaktywacji może być też degradacja łańcuchów poliptedydowych). Konformację enzymu stabilizują:
· konwalencyjne wiązania -s-s- ; oraz niekowalencjne
· wiązania wodorowe
· oddziaływania hydrofobowe.
Każda modyfikacja tych wiązań i oddziaływań prowadzaca do uszkodzenia optymalnej struktury przestrzennej enzymu wpływa na zmianę jego aktywności lub całkowitą inaktywację.
Do czynników modyfikujących konformację enzymu należą:
· temperatura
· pH
· siła jonowa
· stała dielektryczna środowiskowa
· obecność związków niszczących wiązania wodorowe i zakłócających oddziaływania hydrofobowe.
A wreszcie odbiegające od optymalnych
· stężenia substratów, produktów reakcji, koenzymów, aktywatorów i inhibitorów.
Temperatura
· Krzywa zależności aktywności enzymatycznej od temperatury posiada najczęściej optimum. Jest ono różne często nawet dla tych samych enzymów pochodzących z różnych źródeł.
· Wynika to z różnej ich podatności na zmiany konformacyjne zachodzące pod wpływem temperatury.
Większość enzymów wykazuje optimum działania w zakresie temperatur 30-50 C i ulega całkowitej inaktywacji po 5 min. ogrzewania w 70 C.
Są również takie,
· które zachowują pełną aktywność po dłuższym ogrzewaniu w 100 C oraz takie,
· które zachowują optymalną strukturę w temp. 10-40 C ulegają inaktywacji w 50 C.
Przyczyny tego zjawiska na poprzednim wykładzie.
Generalnie wzrost temp. Powyżej optymalnego zakresu zwiększa prawdopodobieństwo rozerwania wiązań stabilizujących strukturę przestrzenną.
Ujawniają się grupy boczne aminokwasów zlokalizowanych uprzednio wewnątrz tej struktury,
· wzmaga się ruch poszczególnych atomów i fragmentów cząsteczki co może prowadzić:
· do nowych interakcji całkowicie różnych od istniejących poprzednio.
W tych przypadkach gdy zmiany spowodowane tym procesem nie są zbyt duże, po obniżeniu temp. Do wartości optymalnej obserwujemy zjawisko renaturyzacji. Może ją przyspieszyć jak stwierdzono w licznych przypadkach obecność substratu.
Cześć enzymów ulega inaktywacji po obniżeniu temp. Poniżej 10 C (tab. 1)
Są to enzymy oligometryczne, których podjednostki są zasocjowane głównie w wyniku oddziaływań hydrofobowych. Osłabienie lub zanik tych oddziaływań po obniżeniu temp. Powoduje ich dysocjację na podjednostki. Podjednostki w niesprzyjających warunkach mogą ulegać zmianom. (np. izomeryzacja) wykluczającym możliwość resocjacji po podwyższeniu temp.
Należy pamięta, że szybkość inaktywacji enzymów, wynikająca z modyfikacji ich konformacji pod wpływem temp. Uzależniona jest:
od wielu pozostałych czynników środowiskowych, a w szczególności od
· stężenia soli
· stężenia enzymu podczas ogrzewania.
Modyfikacje niekonwalencyjne zachodzące pod wplywem zmiany pH
Każdy z enzymów posiada optymalną dla swojej aktywności konformację przy określonym zakresie pH (optimum działania enzymu) Jony wodorowe i wodorotlenkowe, w stężeniach powodująch przekroczenie tego zakresu powodują:
· rozrywanie wiązań jonowych i wodorowych pomiędzy gr. funkcyjnymmi łańcuchów bocznych.
· Decydują także o formie w jakiej występują kontaktowe grupy funkcyjne.
Rozerwanie wiązań, stabilizujących optymalną strukturę przestrzenną enzymów i zmiana stopnia dysocjacji aminokwasów kontaktowych powoduje inaktywację enzymu.
Wynika ona ze zniszczenia struktury tych fragmentów cząsteczki enzymu, które są odpowiedzialne za jego katalityczne działanie.
Większośc enzymów już w temp. Pokojowej traci swą aktywność w roztworach o pH<5 i powyżej 8 co związane jest z dysocjacją bocznych grup aminokwasów kwaśnych i zasadowych.(rys.2)
Inne, np. pepsyna są trwałe w pH 1-3, a inaktywują się w środowisku obojętnym. Enzym ten posiada w centrum aktywnym grupy karboksylowe, w tym jedną niezdysocjowaną.
Brak jest wyraźnej zależności przedziału pH, w którym enzymy są stabilne, od wartości ich punktu izoelektrycznego oraz od optimum działania katalitycznego.
Przedział stabilności enzymu należy ustalić doświadczalnie, a otrzymane wyniki uwzględnić podczas procesu izolowania i przechowywania.
· W tym celu: preinkubujemy enzym w roztworach o różnym pH na optymalne, dodajemy substrat i znaczymy aktywność enzymatyczną mierząc ilość produktów.
Na wykresie zależności aktywności enzymu od pH preinkubacji linia równoległa do osi odciętych wskazuje zakres pH w którym enzym jest stabilny.
W tym zakresie nie dochodzi do trwałych zmian konformacyjnych centrum aktywnego.
(Możliwy jest samorzutnie przebiegający, po przywróceniu optymalnego pH proces renaturyzacji).
Poza tym zakresem w charakterystycznie pofałdowanej strukturze łańcuchów polipeptydowych zachodzą zmiany, których nie można odwrócić przez przywrócenie optymalnego pH (rys 3).
Siła jonowa
Przy wysokiej sile jonowej mogą ulegać zakłóceniu:
· interakcje elektrostatyczne stabilizujące konformację enzymu,
· także wiązania wodorowe pomiędzy niezjonizowanymi grupami polarnymi w łańcuchach polipeptydowych enzymu a cząsteczkami wody.
Wprowadzemie do roztworu znacznego stęzenia jonów silnie dysocjującej soli prowadzi do:
· wysolenia białka, czyli do wytrącenia go z roztworu (sól wykazuje silniejsze powinowactwo do wody niż białko- jony są bardziej hydrofilowe niż grupy funkcyjne białka). Białko takie po ponownym rozpuszczeniu odzyskuje właściwą konformację o czym świadczy pełna aktywność enzymatyczna. Zróżnicowane powinowactwo białek do wody, wynikające z różnic w ich konformacji i związaną z tym różną rekcję na różne stężenia silnie dysocjujących soli wykorzystuje się w procesach izolowania enzymów.
Stała dielektryczna
Stała ta wyraża się wykazywaną przez rozpuszczalnik dążność do przeciwstawiania się przyciąganiu elektrostatycznemu między jonami dodatnimi i ujemnymi w cząsteczce enzymu.
Skrajnie wysoka jest stała dielektryczna wody (80) skrajnie niska heksanu (1,9). Siła przyciągania pomiędzy jonami tworzącymi wiązanie przy określonej odległości między nimi w wodzie wynosi:
· 1/40 siły przyciągania w heksanie
· a ¼ w acetonie i 1/3 w etanolu
Stąd częste wykorzystanie tych związków (po uprzednim ochłodzeniu do -20 C) w procesach wytrącania białek enzymatycznych z wodnych wyciągów podczas procesu izolowania enzymów.
e_ładunki jonów
D-stała dielektryczna
r- odległość między jonami
Z kolei rozcieńczanie wodnych roztworów enzymów oligomerycznych może prowadzić do ich dysocjacji na nieaktywne podjednostki.
Niekowalencyjne modyfikacje enzymów pod wpływem
· substratów
· kenzymów
· aktywatorów iinhibitorów
· i ich wpływ na aktywność enzymatyczną
Wpływ tych ligandów zaznacza się szczególnie w przypadku:
enzymów oligomerycznych, gdzie przyłączenie ich lub odłączenie może mieć wpływ na równowagę asocjacji-dysocjacji, związaną często z pojawieniem się lub zanikiem aktywności enzymatycznej.
Struktura przestrzenna białek monomerycznych może być niszczona przez związki jak,
· mocznik (wiązania wodorowe)
· chlorowodorek guanidyny lub
· siarczan dodecylu (zaburzenie interakcji hydrofobowych)
· oraz niekonwalencyjnie wiążący się z grupami – SH p-chlorortęciobenzoesan sodu(PCMB)
Związki te można usunąć:
· ...
beeola