hydroliza tłuszczów.doc

Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności

Biotechnologia

Enzymatyczna hydroliza tłuszczów

Cel ćwiczenia: Przeprowadzenie rekcji hydrolizy tluszczów.

Tłuszcze właściwe to estry gliceryny i wyższych kwasów tłuszczowych. W zależności od

rodzajów kwasów tłuszczowych budujących cząsteczkę tłuszczu można je podzielić na dwie grupy:

              - tłuszcze nasycone w skład cząsteczek tych tłuszczy wchodzą nasycone kwasy tłuszczowe.

Zazwyczaj tłuszcze te są ciałami stałymi, ale istnieją wyjątki np. tran. Naturalnie tłuszcze nasycone są pochodzenia zwierzęcego. Zaliczmy do nich m.in. słoninę, masło, smalec.

              -tłuszcze nienasycone w skład cząsteczek tych tłuszczy wchodzą zarówno nasycone kwasy tłuszczowe jak i nienasycone kwasy tłuszczowe. Tłuszcze te są zazwyczaj cieczami, ale istnieją wyjątki np. margaryna. Naturalnie tłuszcze nienasycone są pochodzenia roślinnego. Można do nich zaliczyć m.in. oliwkę z oliwek, olej słonecznikowy, olej sojowy.

Tłuszcze ulegają reakcjom hydrolizy, czyli reakcjom, w czasie której cząsteczka tłuszczu ulega rozpadowi na glicerol oraz kwasy tłuszczowe. Hydroliza zachodzi pod wpływem enzymów (hydroliza enzymatyczna) lub w odpowiednim zasadowym środowisku.

Hydroliza zasadowa zachodzi nieodwracalnie- jest reakcją o zastosowaniu przemysłowym, jej

produktami są mydła i sole wyższych kwasów tłuszczowych. Przykładowa reakcja hydrolizy

zasadowej:

Rys 1. Zasadowa hydroliza tłuszczów.

Za hydrolizę enzymatyczną odpowiedzialne są enzymy- lipaz. Enzymy te należą do klas hydrolaz i zwanych zgodnie z klasyfikacją międzynarodową- acylohydrolazami triacylogriceroli. Lipazy są szeroko rozpowszechnione- występują w tkankach zwierzęcych np. trzustka, roślinnych- w nasionach roślin oleistych, oraz w różnych drobnoustrojach. Produktami hydrolizy enzymatycznej mogą być: glicerol, kwasy tłuszczowe czy diacylogricerole. Hydroliza tłuszczu przebiega najszybciej, gdy jest on w postaci emulsji.

Przykładowa reakcja hydrolizy enzymatycznej:

Rys 2. Enzymatyczna hydroliza tłuszczów.

Aktywność

Proszę podać co jest substratem dla lipazy, jakie są produkty i w jaki sposób mierzy się ilość tych produktów.

preparatu lipazy oblicza się według wzoru:

AL=(A-A0)*50/N*t

AL- aktywność lipazy

A- objętość 0,05 M NaOH zużyta na odmiareczkowanie próby właściwej (ml)

A0- objętość 0,05 M NaOH zużyta na odmiareczkowanie próby kontrolnej (ml)

n- ilość  preparatu lipazy w ml lub mg w mieszaninie reakcyjnej

50- przekicznik pozwalający przeliczyć cm3 0,05 M NaOH na   µmol kwasu tłuszczowego

t- czas w minutach

LABORATORIUM Z BIOCHEMII

ENZYMATYCZNA HYDROLIZA TŁUSZCZÓW

Metodyka wykonania ćwiczenia:

Zestawienie wymaganych odczynników, materiałów i sprzętu:

Preparaty lipazy:

• ekstrakt trzustki,

• preparaty farmaceutyczne,
• inne biopreparaty zawierające lipazy,
• tłuszcz roślinny i zwierzęcy,
• mleko,
• 2%- owy alkoholowy roztwór tymoloftaleiny,
• 0,1M bufor fosforanowy o pH 7,
• etanol skażony,
• Kolby erlenmayera (100 ml), cylindry miarowe (100 ml), pipety miarowe (1, 5, 10 ml), biureta, statyw z probówkami, homogenizer, moździerz porcelanowy.

1. Przygotowanie preparatu lipazy z preparatu Kreon:

Jedną tabletkę preparatu Kreon rozdrobniono w moździerzu i zawieszono w 50 ml 0,1M buforu o pH 7. Tak przygotowaną zawiesinę rozcieńczono według wskazań prowadzącego …-krotnie.

Proszę wpisać wartość, którą była podana podczas wykonywani aćwiczenia.

2. Przygotowanie emulsji oleju:

60 ml

Proszę wpisać ilość, którą pobierana była na ćwiczeniach.

2%- owego wodnego roztworu alkoholu poliwinylowego zmieszano z 40 ml oleju i homogenizowano 5 minut. Uzyskaną emulsję zastosowano jako substrat w reakcji.

3. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej i przeprowadzenie reakcji:

Przygotowano 3 erlenmayerki o poj. 100 ml i wprowadzono substancje uwzględniając podaną kolejność.

2 próby właściwe: do dwóch erlenmayerek wprowadzono:

• 5 ml emulsji,

• 4 ml buforu,
• 1 ml wyciągu z trzustki,

po 30 minutach (pierwsza próba) i po 60 minutach (druga próba) inkubacji w temperaturze 370C dodano po 10 ml etanolu.

1 próba kontrolna: do jednej erlenmayerki wprowadzono:

a)                  5 ml emulsji,

b)                 4 ml buforu,

c)                  10 ml etanolu,

d)                 1 ml wyciągu z trzustki.

Tak przygotowane mieszaniny miareczkowano 0,05M NaOH wobec tymoloftaleiny (2- 3 krople) do niebieskiego zabarwienia.

Wyniki zestawiono w Tabeli.

Tabela 1. Ilość zużytego NaOH na zmiareczkowanie mieszaniny reakcyjnej i wartość aktywności enzymu.