Molekularna organizacja informacji genetycznej i jej zaburzenia
Cytogenetyczna nomenklatura chromosomów człowieka
· klasyfikacja chromosomów człowieka (7 grup)
Za kryteria klasyfikacji przyjęto:
1) wielkość chromosomów
2) położenie centromeru
3) rozmieszczenie prążków w chromosomach
Na podstawie powyższych kryteriów wyodrębniono poszczególne pary homologicznych chromosomów somatycznych (autosomów) oznaczone numerami od 1 do 22. Chromosomy płci (heterochromosomy) wydzielono jako odrębną parę i oznaczono symbolami X i Y. Autosomy podzielono na 7 grup od A do G. Chromosom X jako najbardziej podobny do chromosomów 6 pary przydzielono do grupy C, a chromosom - do grupy G.
Do grupy A zaliczono pary 1-3. Chromosomy 1 i 3 to duże chromosomy metacentryczne. Chromosom 2 jest submetacentryczny.
Do grupy B zaliczono pary 4-5. Są to duże chromosomy submetacentryczne
Do grupy C zaliczono pary 6-12 i chromosom X. Wszystkie chromosomy w tej grupie są submetacentryczne, średniej wielkości i odróżnienie poszczególnych par i chromosomu X w barwieniu rutynowym jest niemożliwe.
Do grupy D zaliczono pary 13-15. Są to duże chromosomy akrocentryczne, mogą posiadać nitki satelitonośne i satelity.
Do grupy E zaliczono pary 16-18. Para 16 to chromosomy małe, prawie metacentryczne. Para 17 i 18 to małe chromosomy submetacentryczne.
Do grupy F zaliczono pary 19 i 20. Są to najmniejsze chromosomy metacentryczne.
Do grupy G zaliczono pary 21 i 22. Są to małe chromosomy akrocentryczne, mogą posiadać nitki satelitonośne i satelity. Chromosomy pary 21 są mniejsze niż chromosomy pary 22. Chromosom Y zaś nigdy nie posiada satelitów. W barwieniu rutynowym można go odróżnić od chromosomów pary 21 i 22 charakterystycznym równoległym ułożeniu ramion długich.
chromosomy metacentryczne- gdy centromer jest w środku chromosomu i ramiona górne są równe dolnym
chromosomy submetacentryczne- gdy centromer jest przesunięty bliżej jednego końca i ramiona górne są krótsze od dolnych
chromosomy akrocentryczne- gdy centromer jest położony blisko jednego końca i ramiona górne są bardzo krótkie, a dolne bardzo długie
chromosomy teocentryczne – gdy centromer znajduje się na samym końcu chromosomu i wtedy brak jest ramion górnych, a obecne są tylko ramiona długie. U człowieka chromosomy teocentryczne nie występują, ale występują one u myszy.
Ideogram - wykres obrazujący różnice w wielkościach danego parametru za pomocą wielu takich samych obrazków.
histogram
kariotyp – zestaw chromosomów występujących w komórce somatycznej, właściwy każdemu organizmowi, o charakterystycznej liczbie i morfologii.
zapis wyników badań cytogenetycznych (numeracja prążków, wykaz skrótów, zapis aberracji chromosomowych, zapis loci genów);
Polimorfizm genetyczny
Polimorfizm - w genetyce oznacza występowanie różnic w DNA populacji. Polimorfizmem nie określa się jednak zmian rzadkich. Kryterium zaliczenia do tej kategorii jest, aby dana zmiana była częstsza niż 1% (innymi słowy zbyt częsta, by można było mówić o mutacji).
Polimorfizm można podzielić na:
- SNP (ang. Single Nucleotide Polymorphism) - polimorfizm pojedynczego nukleotydu;
- polimorfizm sekwencji mini - i mikrosatelitarnych.
Polimorfizm może odnosić się do sekwencji kodujących lub niekodujących. Polimorfizm genowy oznacza występowanie różnorodnych odmian danego genu, co w konsekwencji może prowadzić do różnic w budowie i działaniu białka kodowanego przez ten gen. Przykładem jest podatność na działanie alkoholu etylowego wśród rasy azjatyckiej, związana z różnicą w budowie enzymu dehydrogenazy alkoholowej. Natomiast zmiany w sekwencjach niekodujących mogą prowadzić do zmiany ekspresji białek.
Zjawisko polimorfizmu pojedynczych nukleotydów wykorzystuje się w technice RFLP (ang. Restriction Fragments Lenght Polymorphism).
SSLP – polimorfizm długości prostych sekwencji.
SSLP są powtórzeniami prostych sekwencji, przejawiają różnicę w długości, a więc różnymi allelami zawierającymi różną liczbę jednostek powtarzalnych. SSLP może być wieloallelowe, w odróżnieniu od RLFP, bo każdy SSLP może mieć wiele wariantów długości. Istnieją dwa typy SSLP:
· polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych [STRP = short tandem repeat polymorphism], znane również jako proste powtórzenia tandemowe, w których powtórzeniami są znacznie krótsze jednostki, przeważnie 2-,3- lub 4-nukleotydowe.
· polimorfizm sekwencji minisatelitarnych [VNTR = variable number tandem repeats]
znane także jako zmienna ilość powtórzeń tandemowych, w którym jednostka powtarzalna ma kilkadziesiąt nukleotydów długości.
Jako markery mikrosatelity są o wiele bardziej popularne niż minisatelity z 2 powodów.
> Po pierwsze, minisatelity nie są równo rozprzestrzenione w genomie, lecz częściej znajduje się je bliżej końców chromosomów. Mikrosatelity są dogodniej rozmieszczone w genomie.
>Po drugie. Najszybszym sposobem oznaczania polimorfizmów długości jest reakcja PCR, a za jej pomocą znacznie szybciej i dokładniej oznacza się sekwencje krótsze niż 300 bp. Większość alleli minisatelitarnych jest dłuższa, gdyż jednostki powtarzalne są stosunkowo długie i często jest ich wiele w jednym ciągu. Typowy mikrosatelita zawiera 10-30 kopii powtarzalnej sekwencji nie dłuższej niż cztery bp, i dlatego lepiej nadaje się do oznaczenia w reakcji PCR. Dotychczas w genomie człowieka znaleziono około 10 000 mikrosatelitów, ale prawdopodobnie jest ich znacznie więcej.
· polimorfizm pojedynczych nukleotydów [SNP = single nucleotide polymorphism] – zwane inaczej polimorfizmami punktowymi. Stanowią bardzo licznie występujące w genomie pojedyncze mutacje punktowe. Niektóre równocześnie prowadzą do RFLP, choć nie większość, ponieważ sekwencji, w obrębie których leżą SNP, nie rozpoznaje żaden enzym restrykcyjny. Uważa się, że w genomie człowieka jest ponad 20 000 SNP położonych w genach i prawdopodobnie dziesięć razy tyle, a możę i więcej w DNA pozagenowym. Każdy SNP ma tylko 2 allele, zatem z punktu widzenia mapowania genów człowieka ma te same wady co RFLP, istnieje duże prawdopodobieństwo, że wszyscy członkowie rodziny będą homozygotyczni pod względem pojedynczego SNP. Zaletą SNP jest ich olbrzymia liczba i możliwość oznaczania metodami nie wymagającymi elektroforezy w żelu. Jest to istotne dlatego, że elektroforeza w żelu jest trudna do zautomatyzowania, więc każda metoda detekcji na niej oparta będzie stosunkowo powolna i pracochłonna. Wykrywanie SNP jest szybkie, gdyż opiera się na analizie hybrydyzacji z oligonukleotydami. Oligonukleotyd to krótka, syntetyzowana chemicznie, jednoniciowa cząsteczka DNA, zwykle krótsza niż 50 nukleotydów. Jeśli warunki są odpowiednie, oligonukleotyd będzie hybrydyzował z inną cząsteczką DNA tylko wtedy, gdy na całej swojej długości utworzy z nią pary nukleotydów. Jeśli pojawi się jednonukleotydowa różnica, jedna pozycja oligonukleotydu nie utworzy pary i hybrydyzacja nie zachodzi. Hybrydyzacja z polinukleotydami pozwala rozróżnić dwa allele SNP. Strategia poszukiwania obejmuje następujące sposoby:
Ø Technologię „chip” DNA
Ø Dynamiczną hybrydyzację specyficzną dla allelu (DASH)
Metodyka analiz cytogenetycznych: techniki hodowli komórkowych – limfocytów, fibroblastów, amniocytów, komórek trofoblastu, indukowana transformacja blastyczna
· fitohemaglutynina (faseolina) – stymulator wzrostu do namnażania komórek z pobranego materiału w hodowli in vitro
· kolchicyna - alkaloid wytwarzany przez zimowit jesienny, działa niszcząco na wrzeciono kariokinetyczne w czasie mitozy lub mejozy oraz na cytoszkielet komórki, poprzez uniemożliwianie polimeryzacji mikrotubul. Prowadzi to do nierozdzielenia chromosomów do komórek potomnych i zwiększenia u nich liczby chromosomów. Kolchicyna wykorzystywana jest w rolnictwie do wytwarzania poliploidów. Poza tym jest silną trucizną.
· Kolcemid – używany w cytogenetyce jest pochodną kolchicyny, ale jest mniej toksyczny. Depolimeryzuje mikrotubule i ogranicza ich formowanie, co zatrzymuje komórki w metafazie.
· szok hipotoniczny (chlorek sodu) – jest to roztwór 0,075 M NaCl. Jego działaniu poddawane są preparowane komórki w celu uzyskania rozproszenia chromosomów. (Następnie komórki są utrwalane w mieszaninie lodowatego kwasu octowego i metanolu).
· Kariogram - graficzne przedstawienie zestawu chromosomów danej komórki.
Kariogram sporządza się, wykonując mikrofotografię wybarwionych prążkowo płytek metafazowych, a następnie z otrzymanych odbitek fotograficznych wycina sięchromosomy i układa w pary homologiczne, stosując kryteria wielkości, położenia centromeru oraz wzorów prążkowych.
Zasady sporządzania kariogramu opracowano na międzynarodowej konferencji cytogenetycznej w Paryżu w 1971 r.
· uzyskiwanie amniocytów przez amniopunkcję – komórki płynu owodniowego (Amniocyty) uzyskiwane są przez amniopunkcję między 15-18 tygodniem ciąży. Czas badania wynosi około 10-21 dni.
· otrzymywanie komórek trofoblastu metodą aspiracji – komórki trofoblastu otrzymuje się drogą aspiracji przez powłoki brzuszne lub przez szyjkę macicy między 10-14 tyg. ciąży
Metody analizy chromosomów – barwienia: GTG, HRT, QFQ, RHG, CBG, technika Ag-NOR
Barwienie GTG – wykrywanie prążków G
Barwienie QFQ – wykrywanie prążków Q
Barwienie RBA – wykrywanie prążków R
Barwienie CBG – wykrywanie prążków C
Barwienie HRT (High Resolution Technique) – metoda uzyskiwania chromosomów o zwiększonej rozdzielczości obrazu prążkowego (chromosomy prometafazowe i profazowe).
· prążki G – wybarwia się je najczęściej traktując preparaty chromosomowe enzymami proteolitycznymi, np. trypsyną i barwi barwnikiem Giemsy. Otrzymujemy wówczas chromosomy wybarwione na prążki ciemne i na prążki jasne. Ciemne prążki G odpowiadają regionom o dużej zawartości par zasad A-T z późno replikującym DNA. Regiony te zawierają heterochromatynę z nielicznymi aktywnymi genami. Od prążków jasnych różnią się także zawartością i składem białek. Ta heterochromatyna bogata jest w mostki siarczkowe S-S. Duża ilość wiązań zawierają białka niehistonowe.
Prążki jasne odpowiadają regionom o dużej zawartości par zasad G-C i jest to wcześnie replikująca euchromatyna.
Wzór prążków G jest unikatowy dla każdej pary homologów. Prążki obrazują odmienną kondensację chromatyny co umożliwia identyfikację każdego chromosomu z pary homologicznej.
· prążki Q – do ich wybarwiania używa się 2 rodzajów fluorochromów:
1) mających zdolność do jonowego wiązania DNA i zdolność do interakcji między płaszczyznę jego zasad, np. oranż akrydynowy
2) fluorochromy interkalujące do podwójnego łańcucha DNA i wykazujące powinowactwo do pewnych zasad, np. atebryna (Q) i jej pochodne oraz iperyt akrychinowy (QM)
Silnie fluoryzujące prążki ujawniają regiony DNA bogate w pary A-T, wygaszanie fluorescencji – pary G-C.
Niektóre części chromosomów człowieka wykazują bardzo silną fluorescencję, np:
Ø Okolice centromeru chromosomu 3 z grupy A
Ø Satelity chromosomów akrocentrycznych
Ø Dystalne odcinki ramion długich chromosomu Y
· prążki R – stanowią odwrotność prążków G (rejony w prążkach G zabarwione na ciemno w prążkach R są jasne i na odwrót)
Ciemne prążki R – rejony chromosomów zawierające DNA bogaty w pary C-G, jasne prążki zaś – A-T. Wzór prążków R może być uzyskiwany różnymi technikami (RHG, RBA, RBG). Barwienie to ujawnia drobne aberracje niedostrzegalne przy wybarwianiu prążków G lub C.
· prążki C – przy pomocy wybarwiania prążków C wykrywa się heterochromatynę konstytutywną. Prążki C wybarwiają się barwnikiem Giemsy w obszarze heterochromatyny centromerowej i przycentromerowej chromosomów po uprzedniej ich inkubacji w roztworze wodorotlenku baru. Rejony te zbudowane są z powtarzających się sekwencji satDNA związanego silnie ze specyficznymi białkami niehistonowymi, które chronią DNA.
Barwienie chromosomów człowieka na obecność prążków C ujawnia wybarwione na ciemno regiony centromerów i okolice przycentromerowe (przewężenia wtórne). Co ciekawe, u człowieka wielkość przewężeń wtórnych chromosomów par 1,9 i 16 jest cechą polimorficzną.
Barwienie metodą AgNOR – jest to barwienie organizatorów jąderkowych.
Organizatory jąderka zlokalizowane są w nitkach satelitonośnych chromosomów akrocentrycznych. Zawierają geny rybosomalne dla 18S i 28S rRNA. Organizatory w których odbywa się transkrypcja rRNA są wybarwiane azotanem srebra.
Ta metoda barwienia służy do badania polimorfizmu nitek satelitonośnych i satelitów oraz aberracji ramion krótkich chromosomów akrocentrycznych.
Ponadto metoda AgNOR jest również stosowana do identyfikacji chromosomów markerowych, które często są utworzone z ramion krótkich chromosomów akrocentrycznych.
· heterochromatyna konstytutywna - to heterochromatyna z bardzo ciasno upakowanym DNA, który w większości nie bierze udziału w procesie transkrypcji ...
miloszlo