Opracowanie: Zbigniew Pokora

Aktualizacja, listopad 2012

Biologia molekularna, sylabus 2 bloku tematycznego

Molekularna organizacja informacji genetycznej i jej zaburzenia

Genom

·         Genom jądrowy, genom mitochondrialny, NORs, geny mozaikowe, monocuistronowy mRNA, rodziny wielogenowe, pseudogeny, fragmenty genów, geny w genach, retropozycja, formy reliktowe genów, sekwencje SINE, sekwencje LINE, satelitarny DNA, DNA minisatelitarny, DNA mikrosatelitarny, obszar 3’UTR, obszar 5’UTR, sekwencje unikatowe DNA, sekwencje tandemowe DNA, sekwencje LTR DNA, sekwencje telomerowe, paradoks wielkości C, modele kondensacji chromatyny (patrz sylabus 1 bloku tematycznego), chromatyna płciowa, ciałko Barra, pałeczka dobosza, lionizacja, ciałko Y (chromatyna Y), chromosomy A  B, chromosomy płci, minichromosomy;

Cytogenetyczna nomenklatura chromosomów człowieka

·         klasyfikacja chromosomów człowieka (Denver, 7 grup), chromosomy metacentryczne, chromosomy submetacentryczne, chromosomy akrocentryczne, indeks ramion chromosomu, indeks centromerowy, idiogram, histogram,  kariotyp, kariogram, zapis wyników badań cytogenetycznych (numeracja prążków, wykaz skrótów, zapis aberracji chromosomowych, zapis loci genów);

Polimorfizm genetyczny

·         polimorfizm pojedynczych nukleotydów [SNP = single nucleotide polymorphism]

·         polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych [STRP = short tandem repeat polymorphism]

·         polimorfizm sekwencji minisatelitarnych [VNTR = variable number tandem repeats]

Metodyka analiz cytogenetycznych: techniki hodowli komórkowych – limfocytów, fibroblastów, amniocytów, komórek trofoblastu, indukowana transformacja blastyczna

·         fitohemaglutynina (faseolina), kolchicyna, kolcemid, szok hipotoniczny (chlorek sodu), kariogram, uzyskiwanie amniocytów przez amniopunkcję, otrzymywanie komórek trofoblastu metodą aspiracji;

Metody analizy chromosomów –

·         barwienia absorbcyjne i fluorescencyjne, techniki - GTG, HRT, QFQ, RHG, CBG,

·         Ag-NOR, CMA, DAPI

·         prążki G, prążki Q, prążki R, prążki C, prążki N, prążki T, heterochromatyna konstytutywna, regiony jąderkotwórcze;

Metoda hybrydyzacji in situ i jej pochodne

·         technika FISH, multiplex FISH (=M-FISH), SKY-FISH, Fiber FISH, porównawcza hybrydyzacja genomów, CGH, Array CGH, sonda molekularna (sondy – specyficzne, centromerowe, malujące), fluorochrom;

Analiza chromosomów w cytometrze przepływowym

·         histogram, ocena zawartości DNA, ocena stosunku par AT/GC w poszczególnych chromosomach;

Aberracje chromosomalne strukturalne (translokacje, insercje, inwersje, izochromosomy, delecje, duplikacje, chromosomy koliste i dicentryczne)

·         fuzja centryczna, inwersja pericentryczna (eucentryczna), inwersja paracentryczna (acentryczna), delecja (deficjencja) terminalna i interstycjalna, następstwa aberracji chromosomowych strukturalnych, translokacja insercyjna, translokacje robertsonowskie zrównoważone i niezrównoważone, translokacja wzajemna;

Aberracje liczbowe (euploidia, aneuploidia)

·         aneuploidie (trisomie, monosomie, tetrasomie, nullisomie), euploidie (poliploidie): autopoliploidie, allopoliploidie, kariotypy aneuploidii, kariotypy euploidii,

Molekularne podłoże mutagenezy

Mutacje spontaniczne i indukowane

·         definicja mutagenu, klasy mutagenów, mutagenne działanie: promieniowania UV i o wysokiej energii, kwasu azotowego (deaminacja), metanosulfonianu metylu (metylacja), benzopirenu (tworzenie adduktów), bromku urydyny (interkalacja), psorolenów (indukowanie kowalencyjnych połączeń pomiędzy niciami polinukleotydowymi i w obrębie pojedynczej nici) i analogów zasad;

Mutacje punktowe

·         insercja, delecja, substytucja, inwersja sekwencji DNA w obrębie genu, mutacje w obrębie promotora genu;

Mutacje dynamiczne

·         zespół łamliwego chromosomu X (=FRAXA), FMR1, FMRP*

·         dystrofia miotoniczna (=DM), kinaza proteinowa dystrofii mięśniowej, DMPK*

·         pląsawica Huntingtona, HD, huntingtonina;*

Mutacje miejsc cięcia na granicy intron-egzon

·         sekwencje miejsce rozpoznawania, akceptorowego;

Insercja transpozonów

Przyczyny mutacji sekwencji aminokwasowych produkowanego polipeptydu

·         mutacje zmiany sensu = missense

·         nonsensowne = nonsense

·         zmiany ramki odczytu = frame shift mutations

·         ciche = silent mutations (w sensie mutacje synonimowe) ;

Mechanizmy naprawcze:

·         bezpośrednie usunięcie uszkodzenia

·         naprawa z wycięciem nukleotydu (nucleotide excision repair = NER)

·         naprawa z wycięciem zasady (base excision repair = BER)

·         naprawa błędnie sparowanych zasad (mismatch repair = MMR)

·         naprawa pęknięć dwuniciowych

Niestabilność genomu (chromosomal instability)

Zaburzenia chromosomowe (zespoły)*

·         Pradera-Williego

·         Angelmana

·         Di George’a

·         Williamsa-Beurena

·         Wolfa-Hirschorna,

·         Cri du chat

·         Downa

·         Edwardsa

·         Pataua

·         Turnera

·         Klinefeltera

·         47,XXX

·         47,XYY

·         mężczyźni 46,XX

·         imprinting genomowy (rodzicielskie piętno genomowe);

Elementy biotechnologii

Rekombinowanie i klonowanie DNA

·         bakteriofagi, enzymy restrykcyjne, klonowanie cDNA, klonowanie genów, kosmidy, plazmidy, sekwencje palindromowwe, wektory do klonowania, wektor do ekspresji;

Analiza i zastosowania klonowanego DNA

·         elektroforeza kwasów nukleinowych;

Łańcuchowa reakcja polimeryzacji (PCR)

·         RT-PCR (reverse transcriptase PCR)

·         PCR w czasie rzeczywistym (real time PCR)

·         Multiplex PCR

·         RFLP PCR

·         gniazdowy PCR, zagnieżdżony PCR (nested PCR);

Sekwencjonowanie kwasów nukleinowych

·         metoda Sangera

·         metoda Maxama-Gilberta

·         pirosekwencjonowanie;

Organizmy modyfikowane genetycznie (GMO)

·         rośliny transgeniczne, zwierzęta transgeniczne,

·         ochrona środowiska przed genetycznie modyfikowanymi organizmami;

Metody wykrywania mutacji

·         RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

·         SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)

·         ASO (Allele Specific Oligonucleotide hybridization)

·         heterodupleksy: HA (lub HET = Heteroduplex Analysis, CMC = Chemical Mismatch Cleavage)

·         DGGE ( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

·         mikromacierze DNA ( oligonukleotydowe, cDNA)

·         Southern Blot (Southern Blotting)

·         Western Blot (Western Blotting)

·         Northern Blot (Northern Blotting);

Komórki macierzyste

·         komórki totipotentne, pluripotentne, multipotentne, unipotentne, embrionalne komórki macierzyste, somatyczne komórki macierzyste, kliniczne zastosowania komórek macierzystych;

Terapia genowa

·         podaż genu terapeutycznego, wektory – wirusowe i syntetyczne, strategie ex vivo i in vivo, komplementacja defektu genetycznego, hamowanie ekspresji zmutowanego genu, korekta zmutowanego genu, antysensy, rybozymy, siRNAs, naprawa mutacji z udziałem oligonukleotydów/fragmentów DNA, eliminacja niepożądanych komórek (metody eliminacji bezpośredniej i pośredniej), modyfikacja genetyczna komórek; kliniczne zastosowania terapii genowej.

Poziomy komunikacji międzykomórkowej

·         ligand, receptor, receptory błonowe, białka G, transbłonowe receptorowe kinazy treoninowe, receptory śródplazmatyczne, wtórne przekaźniki (second messengers), czynniki transkrypcyjne, ścieżki sygnalizacyjne, autokrynia, parakrynia, endokrynia, justykrynia, crosstalk;

Ścieżka sygnalizacyjna Wnt/WNT

·         Lrp 5/6, Axin, Apc, Gsk3, Frizzled, Tcf/Lef, Dsh = Dishevelled, Kremen1, Kremen2, Dkk, kanoniczna ścieżka Wnt i jej niekanoniczne warianty;

·         FAP (ang. Familial Adenematous Polyposis Coli, rodzinna gruczolakowatość jelita grubego*);

Ścieżka sygnalizacyjna Shh/SHH

·         SHH (IHH, DHH), 25 kDa SHH-C, 20 kDa SHH-N, PATCHED, Smoothened, białka GLI, Dickkppfs, sFrps;

·         nowotwory (PATCHED), polidaktylia (SHH, GLI2, GLI3, PATCHED);

Ścieżka sygnalizacyjna TGFβ

·         BMPs, BMPR I, BMPR II, SMADs, SARA, HGS;

·         nowotwory, nadciśnienie w zbiorniku płucnym (BMPR II);

* UWAGA – w stosunku do opisanych w sylabusie schorzeń/zespołów chorobowych obowiązuje wyłącznie znajomość ich podłoża dziedzicznego, ewentualnie molekularnego, jakość obrazu klinicznego nie będzie wymagana. Uwaga ta dotyczy wad rozwojowych i schorzeń genetycznych, które zostały zanaczone gwiazdkami, w przypadku schorzeń pasożytniczych (3 blok tematyczny) obowiązuje znajomość oznak/objawów w zakresie podstawowym.

4