Dla wektorów z miejscem polilinkerowym :
1. gdy mamy mieć dodatkowy peptyd fuzyjny na N końcu
FP :5` NNN[miejsce restrykcyjne -> skoro się tak czepia, to może sekwencja miejsca restrykcjynjego dla wybranego enzymu ALE NIE PISZ KODUJĄCA] ATG [sekwencja kodująca peptyd fuzyjny] sekwencja kodująca
RP : 5` NNN[sekwencja odwrócona komplementarna do sekwencji miejsce restrykcyjne]—odwrócona sekwencja komplementarna do nici antysensownej
bez odwróconego kodonu stop -> jeżeli ma zawierać jakies miejsce fuzyjne z wektora to nie ma kodonu stop, ale jeśli nie, to musi mieć kodon stop J kodon stop jest dla transkrypcji, natomiast replikacja zajdzie normalnieJ
2. gdy mamy mieć dodatkowy peptyd fuzyjny na C-końcu
FP : 5` NNN[miejsce restrykcyjne]ATG sekwencja kodująca
RP: 5` NNN [miejsce restrykcyjne] STOP [odwrócona sekwencja peptydu fuzyjnego] odwrócona sekwencja komplementarna do nici antysensownej
3. gdy znaczniki maja być w wektorze
FP : 5` NNN[miejsce restrykcjne] ATG tutaj ATG nie powinno być, jeśli znacznik będzie na N-końcu, bo wtedy ATG jest zawarte w wektorze, a drugie ATG może spowodować, że powstanie część białek bez linkera na N-końcu [sekwencja kodująca
miejsce restrykcyjne za znacznikiem w wektorze
RP: 5` NNN[miejsce restrykcyjne][odwrócona sekwencja komplementarna do nici antysensownej]
miejsce restrykcyjne przed znacznikiem
4. gdy po ekspresji do wektora białko nie ma mieć znaczników
FP 5` NNN[miejsce cięcia] ATG sekwencja kodująca
miejsce cięcia znajdujące się jako pierwsze przy końcu 5` przed znacznikiem
RP 5` NNN[miejsce restrykcyjne][odwrócony kodon STOP] odwrócona sekwencja komplementarna do nici antysensownej
miejsce cięcia za znacznikiem
5. gdy znacznik mamy na N- końcu już w wektorze
FP : 5` NNN [ MIEJSCE CIĘCIA] ATG BEZ ATG ---SEKWENCJA KODUJĄCA
miejce cięcia jest za znacznikiem
RP : 5` NNN [ CIĘCIE] [ODWRÓCONY STOP] odwrócona sekwencja komplementarna do nici antyrównoległej
miejsce cięcia jest za znacznikiem
6. gdy znacznik mamy na C – końcu juz w wektorze
FP : 5` NNN[ CIĘCIE] ATG –SEKWENCJA KODUJĄCA
miejsce cięcia znajduje się przed znacznikiem
RP : 5` NNN [ CIĘCIE] –odwrócona sekwencja komplementarna do nici antyrównoległej
bez odwróconego kodonu STOP w odwróconej sekwencji
miejsce restrykcyjne jest przed znacznikiem
Do wektorów typu TOPO TA :
tutaj terminalna transferaza dorabia tyminy w wektorze a polimeraza Taq zostawia adeniny na końcach sekwencji , w ten sposób fragmenty się ligują , więc nie używamy restryktaz
1. gdy chcemy mieć znacznik na N – końcu dodatkowy
FP : 5` ATG [sekwencja peptydu fuzyjnego] –sekwencja kodująca
RP 5` odwrócony stop –odwrócona sekwencja komplementarna
2. gdy chcemy mieć znacznik na C – końcu dodatkowy
FP : 5` ATG ---sekwencja kodująca
RP : 5` [odwrócony stop] ( odwrócona sekwencja peptydu fuzyjnego] –odwrócona sekwencja komplementarna
3. gdy mamy znacznik na C- końcu a na N końcu dodatkowy
FP : 5` ATG [ znacznik ]—sekwencja kodująca
RP : 5` odwrócona sekwencja komplementarna bez kododnu STOP
4. gdy znacznik mamy już na C-końcu
FP : 5` ATG –sekwencja kodująca
RP : 5` odwrócona sekwencja komplementarna bez STOP
Petroc