Kolokwium PCR 2013 oprac.docx

Ponieważ koledzy z weterynarii wcześniej zdawali koło z PCRów i byli tak mili żeby się podzielić oto one :
1. Dobrać warunki do reakcji typu hot-start ( genomowe DNA )
2. Zaprojektować primery z N-tagiem i C- tagiem, mając dane enzymy restrykcyjne
3. real-tmie PCR - metody analizy danych
4. Opisac mutageneze przypadkową
5. RACE - mając białko jak uzyskać sekwencję mRNA
6. wielokrotnego wyboru - co jest matrycą dla RT-PCR

Mam nadzieję że wiele się nie zmieni :D

1.       Hot Start i genomowe DNA. Stąd dłuższa denaturacja bo musi się aktywować polimeraza oraz genomowe DNA jest trudniej rozplątywane

2.       N - tag -> pamiętać, żeby wstawić ATG w dobrym miejscu lub ewentualnie usunąć z sekwencji kodującej białko. Pamiętać o ramce odczytu
C - tag -> ramka odczytu, brak kodonu stop

3.       Względne i bezwzględne

a)      względne: metoda Livaka ∆∆CT, metoda Pffafla, metoda relatywnej normalizowanej krzywej standardowej

b)      bezwzględne: metoda krzywej standardowej

Ewentualnie do tego wzory dopisać... ale to chyba nadgorliwość

4.       Mutageneza ukierunkowana (sorka, pomyliłam się, ma być przypadkowa opisana, ale to też proste…)

to proces mający na celu zmianę właściwości białka (np. jego stabilności) lub zbadanie funkcji białka lub odpowiedzi organizmu na zmianę właściwości tego białka poprzez wprowadzenie zmian w sekwencji kodującej interesujące nas białko. W tym celu używamy 2-ch komplementarnych do siebie primerów zawierających zadaną mutację. Mutagenezę przeprowadzamy w reakcji PCR, w której matrycą jest plazmid zawierający sekwencję kodującą interesujące nas białko. Plazmid ten namnożony był wcześniej w bakterii (co oznacza, że jest metylowany). W reakcji PCR w czasie denaturacji dochodzi do rozdzielenia dwuniciowego plazmidu na dwie, jednoniciowe, struktury, a następnie podczas przyłączania dochodzi do przyłączenia się primerów do odpowiednich miejsc (mimo, że nie są to primery w pełni komplementarne, to komplementarność na 3’ i 5’ fragmentach wystarcza - sekwencje komplementarne otaczają mutowany fragment). Następnie dochodzi do wydłużania (syntezy nici z udziałem polimerazy). W reakcji tej jednak nie dochodzi do zamknięcia nici i utworzenia kolistej struktury. Na tym etapie należy dodać enzym restrykcyjny DpnI który rozpoznaje metylowane sekwencje znajdujące się na matrycy (plazmidzie wyjściowym) i trawi w obrębie rozpoznawanych miejsc. Namnożone sekwencje, zawierające mutacje, pozostają nietknięte. Po schłodzeniu dochodzi do utworzenia struktur dwuniciowych, którymi transformujemy bakterie kompetentne zdolne do naprawienia nici i utworzenia kolistej struktury. Następnie selekcja na antybiotyku i mamy kolonie zawierające plazmid zawierający zmutowaną sekwencję kodującą interesujące nas białko.

5.       Wychodząc od białka należy użyć enzymów proteolitycznych w celu ich fragmentacji. Następnie poprzez rozdział na żelu poliakrylamidowym je rozdzielić, przeprowadzić transfer na błonę nitrocelulozową, wybarwić przy użyciu coomasie i przeprowadzić sekwencjonowanie tych fragmentów. Znając sekwencję aminokwasową fragmentów białka, należy przygotować szereg primerów zdegenerowanych w celu namnożenia fragmentu sekwencji kodującej interesujące nas białko. Jeśli któryś zestaw primerów zadziała i uzyskamy satysfakcjonującej nas długości produkt, należy wklonować do plazmidu i poddać sekwencjonowaniu. Jeśli sekwencja nukleotydowa uzyskana w wyniku tego procesu odpowiada sekwencji aminokwasowej fragmentów białka uzyskanych przez nas wcześniej to mamy fragment sekwencji kodującej interesujące nas białko. W kolejnym kroku należy na matrycy sekwencji kodującej INB przeprowadzić 5’ i 3’ RACE PCR w celu poznania całej sekwencji kodującej INB (cDNA wraz z 5’ i 3’ UTR). Następnie sekwencjonujemy uzyskane sekwencje, „składamy” je w całość i wklejamy je do plazmidu.

6.       cDNA