1. W metodzie 5’ Race PCR używany jest enzym transfrazy nukleotydów terminalnych (TNT). Wyjaśnij jakie jest jego działanie, podaj substraty i produkty reakcji katalizowanej przez TNT. Dlaczego matryca dla tego enzymu musi byś specjalnie oczyszczona? W jaki sposób można przeprowadzić oczyszczanie matrycy?
2. Narysuj schematycznie startery do amplifikacji sekwencji kodującej białko przeznaczonej do wklonowania w wektor ekspresyjny za pomocą enzymów restrykcyjnych. Produkt białkowy powinien posiadać znaczniki na N- i C-końcu.
3. Jakie jest prawdopodobieństwo wprowadzenia błędu do sekwencji kodującej białko o masie 110 kDa przez polimerazę Taq? Podać objaśnienia do przeprowadzonych obliczeń.
4. Obliczyć całkowity czas działania programu termocyklera dla amplifikacji fragmentu o długości 2 kbp przez polimerazę Taq obejmujący 20 cykli. (dane w oryginalnym zadaniu mogły się różnić)
5. Opisz krótko technikę Real time PCR wykorzystującą barwniki interkalujące w dwuniciowe DNA. W jaki sposób sprawdza się jednorodność uzyskanych produktów reakcji?
6. Nie uzyskano w reakcji PCR pożądanych produktów. Startery zostały zaprojektowane, a reakcja przeprowadzona zgodnie z ogólnie przyjętymi zasadami. Jakie mogły być tego przyczyny? Zaproponuj zmiany jakie można wprowadzić w celu poprawienia wyników eksperymentu. Wyjaśnij jaki wpływ mają te zmiany na przebieg reakcji.
Petroc