25.11.pdf

(601 KB) Pobierz
WYKŁAD 6 25.11 SZUKANIE ENZYMÓW WYKORZYSTYWANYCH W PRZEMYŚLE
Informacje pochodzące z innych źródeł niż wykład
Szukając enzymów wykorzystywanych w przemyśle wśród drobnoustrojów, których nie da się wyhodować w laboratorium,
należy przenieść odpowiednie fragmenty genów do komórek, które następnie będą produkować te enzymy na poziomie
mRNA lub białkowym.
Tworzy się tzw.
biblioteki metagenomowe;
obejmujące krótkie DNA (kodują na ogół jedno biało, ok. kilka tysięcy pz) lub
dłuższe fragmenty (kodujące najczęściej cząsteczki syntezowane przez szereg enzymów, ok. kilkadziesiąt tysięcy pz).
Wprowadzane są one do odpowiednich wektorów a następnie transformuje się nimi odpowiednie drobnoustroje (klony).
W zależności od tego, czego szukamy należy dostosować odpowiednie techniki, metody do ich odszukania, wyznaczenia.
Skrining
to zespół selektywnych zabiegów, które mają na celu wykrycie i wyizolowanie spośród dużej liczby
drobnoustrojów tylko tych, które odpowiadają konkretnym wymaganiom technologicznym oraz wstępne sprawdzenie ich
przydatności do danego procesu.
Screening biblioteki/banku genów
(prowadzone na szalkach Petriego) – dodanie do podłoża odpowiedniego substratu dla
enzymu w zależności od tego, co ma rozkładać a następnie obserwacja zmian wokół kolonii (np. dla celulaz – celuloza
zabarwiona barwinkiem), to
tzw. metoda bezpośrednia.
Jako nowszą alternatywę screeningu stosuje się
High-throughput screening assay (HTS) (Wysoko wydajny skrining)
–
hodowla na wielodołkowych płytkach. Służy do badania aktywności enzymów, związków chemicznych, leków w różnych
obszarach biologii.
Zminiaturyzowane testy płytkowe. Prowadzi do miniaturyzacji i automatyzacji oraz umożliwia testowanie znacznej liczby
próbek. Wysoko wydajne techniki, bez względu od celu zastosowania, umożliwiają równoczesne badanie wpływu licznych
czynników, takich jak rodzaj
linii komórek,
stężenie składników pokarmowych,
źródło węgla i azotu,
pH czy temperatura
na
efektywność procesu produkcji.
Prowadzenie doświadczeń charakteryzujących się wysokim stopniem automatyzacji
umożliwia równoczesne nadzorowanie dużej ilości jednocześnie prowadzonych eksperymentów. Dodatkowo, objętość
mieszanin reakcyjnych jest zminimalizowana, co znacznie obniża koszty prowadzonych doświadczeń. Przykładami
zastosowań wysoko wydajnych technik mogą być: identyfikacja dzikiej linii komórek wykazujących nową aktywność
enzymatyczną, skrining bibliotek komórek pod kątem zwiększonej syntezy metabolitów czy ewolucja enzymów pod kątem
zwiększonej specyficzności.
Firmy metagenomiczne poszukujące enzymów, wykorzystanie enzymów w przemyśle
Zastosowanie technologii metagenomicznej
TECHNOLOGIE
DirectEvolution technologies (ukierunkowana ewolucja enzymów)
Metoda oferowana przez firmę Diversa Corp.
Przeprowadzenie „ewolucji w probówce” w celu pozyskania enzymów o najbardziej pożądanych cechach i właściwościach
za pomocą nieukierunkowanej mutagenezy (random mutagenesis) a następnie tworzy się
randomowe biblioteki mutantów,
które wyszukuje się na drodze screeningu. Tworzy się biokatalizatory lepiej spełniające swe funkcje, często obdarzone
właściwościami, których w naturze nie zidentyfikowano.
Dochodzi do wymiany każdego aminokwasu (kodonów).
Można również zastosować mutagenezę ukierunkowaną w przypadku, gdy chcemy zmienić domenę nam znaną np. domenę
odpowiadającą za oddziaływania między białkami zmienić tak, aby te oddziaływania były silniejsze.
Polega ona na zastosowaniu kolejno: przypadkowej mutagenezy (random mutagenesis), technologii rekombinacji DNA i
skriningu uzyskanych nowych białek. Wykonanie takiej „przyspieszonej" ewolucji in vitro wymaga:
Identyfikacji genu kodującego dany enzym,
Wyboru organizmu do ekspresji i sekrecji enzymu przed i po mutacjach,
Opracowania wydajnego i niezawodnego systemu skriningu (w celu szybkiej identyfikacji żądanej cechy, najlepiej w sposób
całkowicie zautomatyzowany).
Używana do uzyskiwania enzymów o podwyższonej termostabilności, wyższej aktywności w rozpuszczalnikach
organicznych oraz zwiększenia ich specyficzności substratowej
Mikrokapsułkowanie
Polega na prowadzeniu hodowli pojedynczych komórek w mikrokapsułkach przepuszczalnych dla składników. Bakterie
rozcieńcza się w ten sposób, żeby pojedyncza komórka znalazła się w jednej mikrokapsułce. Tworzy się warunki podobne do
tych, z których pochodzą dane mikroorganizmy poprzez tworzenie ekstraktów/pożywek, którymi następnie traktuje się te
mikrokapsułki (np. ekstrakty gleby, woda morska) w kolumnach hodowlanych. Po hodowli, gdy mikroorganizmy wyrosną
można przenieść je do płytek wielodołkowych dodając odpowiedniego substratu dla szukanego enzymu a następnie
odnotować zmiany w obrębie dołków.
Po uzyskaniu wyników można zoptymalizować warunki hodowli lub wyizolować DNA w celu odszukania danego genu.
BIOPALIWA
Biopaliwem nazywane są stałe, płynne lub gazowe paliwa produkowane z biomasy, czyli materii organicznej zawartej w
żywych organizmach. W skład biomasy wchodzą wszelkie substancje organiczne, pochodzenia roślinnego oraz zwierzęcego,
jak również produkty pozyskane z ich przetworzenia. W odróżnieniu od standardowych źródeł energii biopaliwa mają
charakter odnawialny, a ich zastosowanie ogranicza negatywny wpływ pozyskiwania energii na środowisko, włączając
spadek emisji gazów cieplarnianych.
Biopaliwa uzyskuje się poddając biomasę szeregowi przemian biochemicznych, termochemicznych i biologicznych. W
zależności od metod zastosowanych do ich produkcji, podzielono je na generacje.
Generacja I
Stosuje się rośliny, które są jadalne przez człowieka np. kukurydza, pszenica, rzepak.
Generacja II
Stosuje się odpady rolnicze tj. słoma, odpady roślinne, biomasa lignocelulozowa. Nie stanowią konkurencji dla produkcji
pożywienia dla ludzi ani pasz dla zwierząt.
Generacja III
Określane, jako paliwa przyszłości, otrzymywane są z oleju produkowanego przez algi. Hoduje się określone rosliny (?),
które pobierają CO2.
Generacja IV
Jest to generacja, nad, którą dopiero obmyśla się sposób na produkcję surowca do biopaliw. W zamyśle jest wizja tworzenia
magazynów CO2, które następnie w pewien sposób wprowadzałoby się do roślin wykorzystywanych do produkcji biopaliw.
Firmy produkujące biopaliwa
- Solozyme w San Francisco
-
Enzymy niezbędne do produkcji biopaliw:
- degradujące celulozę
- degradujące skrobię
- degradujące ligniny
- degradujące inne cukry
Zdegradowane cukry złożone do cukrów prostych, przyswajalnych przez mikroorganizmy są następnie fermentowane do
etanolu – biopaliwa.
Problem degradacji celulozy
Produkcja biopaliw spotyka się z trudnością degradacji celulozy, dlatego więc poszukuje się enzymów w środowisku i
organizmach zdolnych do degradacji tego wielocukru metodami metagenomicznymi. Poszukuje się też amylaz, ligninaz,
glukoamylaz w celu ulepszenia ich aktywności.
W tym celu próbuje się wprowadzać odpowiednie geny kodujące celulazy i inne enzymy degradujące cukry do
E.coli.
Ważne
jest, aby celulaza degradowała celulozę od strony zewnętrznej i wewnętrznej (endo i egzo celuloza, czyli posiadała domeny
katalizujące hydrolizę od strony zewnętrznej i wewnętrznej). Próbuje także się stworzyć tzw. „chimery” celulaz, które
zawierają domeny wiążące się z celulozą, domeny katalitzujące hydrolizę celulozy od strony zewnętrznej i wewnętrznej a
następnie chimerę taką poddaje się optymalizacji do warunków za pomocą „ewolucji w probówce”.
Gdzie poszukuje się celulaz i enzymów degradujących cukry?
- termity
- żwacz krowy
- korniki
- gleba
- woda morska
- gorące źródła
TWORZENIE BIBLIOTEKI METAGENOMOWEJ
1. Fragmentacja DNA – sonifikacja, enzymy restrykcyjne
2. Wklonowanie w wektor ekspresyjny z możliwością indukcji ekspresji wstawionego insertu. Należy insert wyklonować tak,
aby nie doszło do przesunięcia ramki odczytu oraz był on wstawiony w odpowiedniej pozycji. Biblioteka musi być
„reprezentatywna” (jak to określiła prof. Zakrzewska)
3. Transformacja
E.coli
lub innego odpowiednio dobranego mikroorganizmu
4. Analiza biblioteki metagenomowej (szukanie białka)
- Stosowanie hodowli na płytkach z odpowiednim substratem dla danego enzymu, którego szukamy a następnie obserwacja
zmian wokół kolonii (powstanie np. barwnego produktu).
- Screening w wielodołkowych płytkach, analiza kolorymetryczna lub zastosowaniem sond.
- Tzw. „inteligentne substraty”, są to substraty, do których doczepiono sondy zawierające wygaszacz i fluorofor, który po
hydrolizie, przez szukany enzym ulegają oddaleniu od siebie (w sensie ten fluorofor i wygaszacz) w wyniku czego powstaje
sygnał świetlny na podstawie, którego analizuje się próbę.
5. Izolacja DNA z docelowego organizmu, docelowego genu i porównanie go z innymi sekwencjami (np. BLAST) w celu
określenia jego pochodzenia itp.
METAGENOMIKA ŚRODOWISKOWA
Bioróżnorodność występuje w:
- gleba
- wody słodkie i morskie
- organizmy (w tym ludzki)
- inne: gorące źródła, wulkany, lodowce itp.
Są to na ogół: bakterie, wirusy, grzyby, pierwotniaki…
Od czego zależy flora bakteryjna u człowieka?
- wiek
- dieta
- stan zdrowia
- stosowanie preparatów antybakteryjnych (np. antybiotyki)
Do miejsc wyjątkowo bogato skolonizowanych należą:
skóra, błony śluzowe górnych dróg oddechowych,
górny i dolny odcinek przewodu pokarmowego (jama ustna, jelito grube), pochwa, ucho zewnętrzne.
Skąpo skolonizowane są:
krtań, tchawica, oskrzela, zatoki boczne nosa, przełyk, żołądek, początek jelita
cienkiego, cewka moczowa, szyjka macicy, spojówka, ucho środkowe.
W ogóle, lub prawie w ogóle nieskolonizowany jest: układ krwionośny

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin