lokalizacja aktywnośći enzymów
lokalizacja aktywnośći fosfatazy w mikroskopie świetlny
procedura
kwaśne fosfatazy należą do hydrolaz podklasy esteraz i katalizują hydrolize różnych estrów fosforanowych zgodnie ze schematem
ester kwasu fosforanowego + H2O → alkohol + H3PO4
wykazują niską specyficzność wobec substratów
więksozsć z nich to glikoproteiny niktóre są metaloproteidami np. purpurowa fosfataza kwaśna znaleziona w nasionach fasoli odmiany red kidney posiada atomy żelaza i cynku w swej cząsteczce
optimum ph 4,8 – 5,5
technika lokalizacji kwaśnej fosfatazy w świetlnym
ester + h2o → alkolchl + kws fosforowy
+ołów
bezbarwny fosforan ołowiu
+siarczek
osad PbS (brunatny)
na podstawie produktu enzymu lokalizujemy enzym
kontrole możliwe:
…
w transmisyjnym elektronowym
stosowany metal: CE (jako CeCl3
więc dostajemy CePO4 czarne (elektronogęste) strąty
lokalizacja roślinnych kwaśnych fosfataz
ze względu na lokalizację w komórce i obszar działanie roślinne kwaśne fosfatazy podzielono na zewnątrzi wewnątrzkomókowe
zewnątrz wysteępują obficie w ścianie i mogą być wydzielane do ryzosfery
wewnątrz cytoplazma aparat Golgiego chroloplast waguola błony plazmatyczne od strony protopalsu ściana wiazki przewodzące nicie infekcyjne w brodawkach korzeniowch
rola w regulacji
wykrywanie aktywności kaśnej fosfatwazy
* spektrofotometycznie
* na żelu SDS
* immunolokalizacja (I rzędowe, II rzędowe przeciwciało znakowane)
Obserwacja
ciemne stronty siaczczku ołowu wewnątrz ścany naczyń, we łowskach
u owadożernych szczególnie dużo we włoskach wydzielniczych
oksydaza cy
II wykrywanie aktwyności dehydrogenazy bursztynianowej przy pomocy nitroBT
płyn inkubacyjny 0,2 M wody roztwró burszytnianu sodu (1ml) 1mg NBT/1ml wody (2ml), 0,2 M bufor fosforanowy pH =7,2
Sole tetrazolowe i formazan są nierozpuszczalne w wodzie o pH = 7,6-8,2 Dehydrogenaaza burszytynianowa jest wrażliwa na utlenianie (w obecności tlenu wodór przejdzie na cytochromy a nie sól tetrazolową). Niektóre jony metali: wapnia sodu gliniu i magenzu aktywują ten enzym.
dehydrogenaza bursztynianowa (enzymatyczny znacznik mitochondriów jedyny enzym cyklu krebsa umieszczony po wewnętrznej stronie wewnętrznej błony otoczki mitochondrialnen
enzym łańcucha oddechowego zbudowany z czterech podjednostek kodowany w jądrze W grupoe prostetycznej enzymu występuje FAD (związany z enzymem)
enzym katalizuje utlenianie burszytaninaiu do fumaranu (usuwane są dwa atomy wodoru w cyklu krebsa. FAD (akceptor) w grupie preostetycznej eznymu przyjmuje wodoru i ulega redukacji do FADH2 E-FADH2 oddaje elektrony na łańcuch oddechowy (cytochrom c)
może redukować egzonenne subtacnje np. nitro BT dyhydrogenaza przenosi wodór z burszytnaiu (donor na akceptor( cytochrom C którym w metodach histochemicznych są sole tetrazolowe Bezbarwana sól nitro BT jest redukowana przed dehydrogenazę burszytanianową do niebeiskiego formazanu
Obserwacja: ciemnogranatowe mitochondria w preparacie z cebuli na brzegu komórki
w ziarniku ciemnogranatowy formazan (wybarwiony zarodek)
ciemnogranatowy formazan
III wykrywanie oksydazy cytochromowej zielenią janusa B (niebeska)
materiał: skórka z wewnętrzne, wklęsłej strony łuski spichrzowej cebluli
odczyniki:
0,02% roztworu zielni najusowej B
6,5% rozstowu sacharozy w dobrze napowietrzonej 2-krotnie destylowanej wodzie
krople 1% rozstworu zielni Janusowej B dodajjemy do 50ml 6,5%roztworu zacharozy
wykonanie:
fragmetny sk¶óki kładziemy na powiechni rozstworu zielni janusowej B na szkiełku zegarkowycm czas barwniea 30-40 min Podczas barwinia napowietrzamy pipetą
preparat umieszczamy w kropli świeżo przytotowanego roztworu zielnieli Janusowej na szkiłęku podsatwowym i przykrywamy nakrywkowym
oglądamy zaraz poprzygotowaniu (zabarwnie szybko znika
pod średnim i dużym powiekszeniem
barwnik po wnikunięciu do komurki ulega redukcji do formy bezbarwnej
jeżeli w komórce jest aktywna oksyzada ulega utleniniu do jasnoniebieskiego
dla oksyzady potrzebny stały dopływ tlenu
pytania
jak wykrywamy mitochondria (rekacja na oksydazę barwnik i wynik
lokazlicaj kwasne fosfatazy do świetlnego
drobiny niebieskie wzdłuż ściany – mitochondrai – utleniona zieleń do jasnoniebieskiego pod wpływem okszydazy
wrib.biologia