bkr 2014-12-02.doc

lokalizacja aktywnośći enzymów

lokalizacja aktywnośći fosfatazy w mikroskopie świetlny

procedura

1. utwalanie skrawków w 2,5% aldehydazie glutarowym na 0,1 M buforze kakodylanowym o pH=7,2 w 0*C (na lodzie) przez 10min
2. płukanie skrawków fuforem kakodylanowym o ph=7,2 w 0*C (4 zmiany po 2 min)
3. inkubacja skrawków w miszainie inkubacyjnyej
4. 1. 0,1 M bufor octanowy o ph=5
   2. 0,5 mM beta-glicerofosfaran sodu
   3. 1mM Pb(NO3)2
   4. czas inkubacji 20 minut w 37*C
5. płukanie skrawków fuforem octanowym o ph=5 (4 zmiany po 2 minuty)
6. inkubacja skrawków 0,01% wodym w (NH4)2S czas inkubacji 1-2 min
7. płukanie w wodzie
8. obserwacja w wodzie

kwaśne fosfatazy należą do hydrolaz podklasy esteraz i katalizują hydrolize różnych estrów fosforanowych zgodnie ze schematem

ester kwasu fosforanowego + H2O → alkohol + H3PO4

wykazują niską specyficzność wobec substratów

więksozsć z nich to glikoproteiny niktóre są metaloproteidami np. purpurowa fosfataza kwaśna znaleziona w nasionach fasoli odmiany red kidney posiada atomy żelaza i cynku w swej cząsteczce

optimum ph 4,8 – 5,5

technika lokalizacji kwaśnej fosfatazy w świetlnym

ester + h2o  → alkolchl + kws fosforowy

+ołów

bezbarwny fosforan ołowiu

+siarczek

osad PbS (brunatny)

na podstawie produktu enzymu lokalizujemy enzym

kontrole możliwe:

…

w transmisyjnym elektronowym

stosowany metal: CE (jako CeCl3

więc dostajemy CePO4 czarne (elektronogęste) strąty

lokalizacja roślinnych kwaśnych fosfataz

ze względu na lokalizację w komórce i obszar działanie roślinne kwaśne fosfatazy podzielono na zewnątrzi wewnątrzkomókowe

zewnątrz wysteępują obficie w ścianie i mogą być wydzielane do ryzosfery

wewnątrz cytoplazma aparat Golgiego chroloplast waguola błony plazmatyczne od strony protopalsu ściana wiazki przewodzące nicie infekcyjne w brodawkach korzeniowch

rola w regulacji

wykrywanie aktywności kaśnej fosfatwazy

* spektrofotometycznie

* na żelu SDS

* immunolokalizacja (I rzędowe, II rzędowe przeciwciało znakowane)

Obserwacja

ciemne stronty siaczczku ołowu wewnątrz ścany naczyń, we łowskach

u owadożernych szczególnie dużo we włoskach wydzielniczych

oksydaza cy

II wykrywanie aktwyności dehydrogenazy bursztynianowej przy pomocy nitroBT

procedura

1. Inkubacja: na szkiełku zegarkowym wlać płyn inkubacyjny i umieścić w nim kilka skrawków epidermy w cebuli i podłużne przekroje ziarniaków przenicy świeżo pobrane
2. inkubować skrawki przez 20-30 min w temp 37*C
3. przepłukać skrawki wodą
4. na szkiełku podstawowym pod szkiełkiem nakrywkowym zamknąć w kropli wody skrawki
5. obserwować pod powiększeniem 40x 100x (imersja), porównać preparaty kontrolne z żywymi
6. wykonać rysunek (jedna żywa komórka)

płyn inkubacyjny 0,2 M wody roztwró burszytnianu sodu (1ml) 1mg NBT/1ml wody (2ml), 0,2 M bufor fosforanowy pH =7,2

Sole tetrazolowe i formazan są nierozpuszczalne w wodzie o pH = 7,6-8,2  Dehydrogenaaza burszytynianowa jest wrażliwa na utlenianie (w obecności tlenu wodór przejdzie na cytochromy a nie sól tetrazolową). Niektóre jony metali: wapnia sodu gliniu i magenzu aktywują ten enzym.

dehydrogenaza bursztynianowa (enzymatyczny znacznik mitochondriów jedyny enzym cyklu krebsa umieszczony po wewnętrznej stronie wewnętrznej błony otoczki mitochondrialnen

enzym łańcucha oddechowego zbudowany z czterech podjednostek kodowany w jądrze W grupoe prostetycznej enzymu występuje FAD (związany z enzymem)

enzym katalizuje utlenianie burszytaninaiu do fumaranu (usuwane są dwa atomy wodoru w cyklu krebsa. FAD (akceptor) w grupie preostetycznej eznymu przyjmuje wodoru i ulega redukacji do FADH2 E-FADH2 oddaje elektrony na łańcuch oddechowy (cytochrom c)

może redukować egzonenne subtacnje np. nitro BT dyhydrogenaza przenosi wodór z burszytnaiu (donor na akceptor( cytochrom C którym w metodach histochemicznych są sole tetrazolowe Bezbarwana sól nitro BT jest redukowana przed dehydrogenazę burszytanianową do niebeiskiego formazanu

Obserwacja: ciemnogranatowe mitochondria w preparacie z cebuli  na brzegu komórki

w ziarniku ciemnogranatowy formazan (wybarwiony zarodek)

ciemnogranatowy formazan

III wykrywanie oksydazy cytochromowej zielenią janusa B (niebeska)

materiał: skórka z wewnętrzne, wklęsłej strony łuski spichrzowej cebluli

odczyniki:

0,02% roztworu zielni najusowej B

6,5% rozstowu sacharozy w dobrze napowietrzonej 2-krotnie destylowanej wodzie

krople 1% rozstworu zielni Janusowej B dodajjemy do 50ml 6,5%roztworu zacharozy

wykonanie:

fragmetny sk¶óki kładziemy na powiechni rozstworu zielni janusowej B na szkiełku zegarkowycm czas barwniea 30-40 min Podczas barwinia napowietrzamy pipetą

preparat umieszczamy w kropli świeżo przytotowanego roztworu zielnieli Janusowej na szkiłęku podsatwowym i przykrywamy nakrywkowym

oglądamy zaraz poprzygotowaniu (zabarwnie szybko znika

pod średnim i dużym powiekszeniem

barwnik po wnikunięciu do komurki ulega redukcji do formy bezbarwnej

jeżeli w komórce jest aktywna oksyzada ulega utleniniu do jasnoniebieskiego

dla oksyzady potrzebny stały dopływ tlenu

pytania

jak wykrywamy mitochondria (rekacja na oksydazę barwnik i wynik

lokazlicaj kwasne fosfatazy do świetlnego

drobiny niebieskie wzdłuż ściany – mitochondrai – utleniona zieleń do jasnoniebieskiego pod wpływem okszydazy