1. Struktura pierwotna i wtórna białka
Pierwotna struktura- I rzędowa- (liniowa, jednowymiarowa): kolejność, sekwencja aminokwasow w łańcuchu polipeptydowym (skład i kolejność decydują o strukturze i funkcji enzymu). Aminokwasy połączone są wiązaniem peptydowym w ustalonej kolejności. Sekwencję aminokwasową odczytuje się zawsze od tzw. N-końca (wolna grupa aminowa) w kierunku C- końca (wolna grupa karboksylowa).
Struktura wtórna- II rzędowa- dotyczy ułożenia w przestrzeni poszczegolnych sąsiadujących ze sobą w sekwencji aminokwasow. Naturalnie skręcony lub rozciągnięty łańcuch białkowy tworzy regularne formy: helisy i b-struktury (struktury pofałdowanej kartki, b-arkusze), zwroty oraz nieregularne pętle. Struktura stabilizowana jest głownie przez wiązania wodorowe pomiędzy jednostkami tworzącymi wiązania peptydowe.
Struktura wtórna III rzędowa- określa przestrzenne powiązania między elementami struktury II-rzędowej (helisami, kartkami i innymi), jak wzajemne oddziaływania między domenami, sposoby fałdowania oraz oddziaływania stabilizujące takie ułożenie. stabilizowana jest przez rodzaje wiązań
niekowalencyjnych:• wiązania wodorowe – wytwarzane przez polarne reszty aa• oddziaływania hydrofobowe – występują pomiędzy niepolarnymi resztami aa• oddziaływania elektrostatyczne („mostki solne”) – tworzą się między przeciwnie naładowanymi grupami, np. końcami N i C peptydow bądź resztami polarnymi jonizującymi (np. Lys i Asp)• siły van der Waalsa – są bardzo słabe i działają jedynie na niewielkie odległości, rowne sumie promieni van der Waalsa atomow pomiędzy ktorymi występują; i kowalencyjnych: •wiązania disiarczkowe – tworzone między resztami siarki pochodzącymi z dwoch reszt cysteiny
struktura wtórna IV rzędowa- opisuje przestrzenne ułożenie podjednostek białkowych. Każda podjednostka jest odrębnym łańcuchem białkowym wchodzącym w skład funkcjonalnego białka. •ze względu na liczbę podjednostek wyróżniamy odpowiednio di-,tri-, tetramery itd. Homooligomery składają się z kilku identycznych
podjednostek, podczas gdy heterooligomery – z różnych
2. Oznaczanie N końcowego aminokwasu
Przeprowadza się reakcję znakowania polipeptydu specyficznym związkiem (np. 2,4-dinitro-1-fluorobenzenem lub chlorkiem dansylu czy też chlorkiem dabsylu), który tworzy stabilne wiązanie kowalencyjne z wolną grupą α-aminową aminokwasu. Użyć można 2,4-dinitro-1-fluorobenzenu (DNFB), który reagując w środowisku zasadowym (pH 8–9) z wolną grupą α-aminową podstawia swój rodnik 2,4-dinitrofenylowy (DNP) w miejsce jednego atomu wodoru grupy aminowej. W reakcji tej powstaje żółto zabarwiona N-DNP-pochodna aminokwasu N-końcowego, która po uwolnieniu w wyniku hydrolizy kwaśnej polipeptydu (6M HCl) może być łatwo zidentyfikowana chromatograficznie. Zastosowanie chlorku dansylu (DNS) do znakowania N-końcowego aminokwasu jest reakcją 100-krotnie czulszą od dinitrofenylowania. Dansylowe pochodne aminokwasów (sulfonoamidy) silnie fluoryzują w świetle nadfioletowym. Równie czuła jest reakcja kondensacji N-końcowych aminokwasów z chlorkiem dabsylu, dostarczająca intensywnie zabarwione pochodne dabsylowe aminokwasów N-końcowych, które po hydrolizie identyfikuje się na podstawie własności chromatograficznych. Mimo dużej czułości większości omówionych metod oznaczania aminokwasów N-końcowych, nie można ich stosować wielokrotnie do analizy tej samej próby polipeptydu, ponieważ podczas hydrolizy kwasowej polipeptyd ulega całkowitej degradacji do wolnych aminokwasów.
3. Metodyoczyszczania białek
• wytrącanie białek roztworami soli (np. siarczanem amonu) – tzw. wysalanie
Wysalanie jest to proces niszczenia otoczki hydratacyjnej wokół białka, co powoduje wzmocnienie oddziaływań hydrofobowych pomiędzy makrocząsteczkami i tworzenie agregatów białkowych.
Najłatwiej wysolić białko w jego punkcie izoelektrycznym, czyli w takim pH, w którym ładunek wypadkowy na jego powierzchni jest równy 0.
• wytrącanie białek rozpuszczalnikami organicznymi (np. etanolem, acetonem lub izopropanolem)
Ekstrakcja wiąże się z obniżeniem stałej dielektrycznej środowiska i ograniczeniem działania wody jako dobrego rozpuszczalnika dla cząstek polarnych.
Taki proces należy prowadzić w obniżonej temperaturze (O°C lub niższej), aby nie nastąpiła nieodwracalna denaturacja białek.
· Metody chromatograficzne
Techniki chromatograficzne są wykorzystywane do separacji białek na podstawie takich parametrów, jak:
• Wielkość i kształt
• Hydrofobowość
• Ładunek powierzchniowy
• Powinowactwo (czyli zdolność do wiązania wybranych ligandów)
Chromatografia wykluczania: rozdziela się białka na podstawie wielkości i kształtu cząstek (filtracja żelowa). Ważne: dobór żelu, ułożenie złoża, szybkość elucji, ilość materiału. Chromatografia jonowymienna: Jest metodą analizy oraz rozdziału substancji rozpuszczalnych, posiadających ładunek elektryczny. najczęściej stosowana technika do rozdziału i oczyszczania. wyróżniamy dwa typy nośników: anonit i kationit. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych: hydrofobowych rozdziela białka na podstawie różnic w sile oddziaływań obszarów hydrofobowych białka z jeszcze bardziej hydrofobowymi grupami ligandów, umocowanymi na powierzchni nośnika pozbawionego ładunku elektrycznego. Chromatografia powinowactwa: wykorzystuje powinowactwo dwóch substancji biologicznie czynnych, zdolnych do tworzenia kompleksów ES, E-Inhibitor.
4. Proenzym- enzym wydzielany w organizmie w postaci nieczynnej, aktywowany do katalizowania określonej przemiany dopiero w określonym miejscu, przy odpowiednich warunkach i pod wpływem odpowiedniego czynnika chem. Zwanego aktywatorem. Katalaza- enzym z grupy oksydoreduktaz katalizujący proces rozkładu nadtlenku wodoru do wody i O2. Celuloza- nierozgałęziony polisacharyd zbudowany liniowo z 300-1400 cząsteczek glukozy połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi.
ewastyna1