Analityka 5.pdf

(838 KB) Pobierz

10.03.2015

dolinabiotechnologiczna.pl/diagnostykalaboratoryjna2/protokolybadandiagn/labowe„knowhow”elisa/?print=print

Labowe „knowhow”: ELISA

Test immunoenzy matyczny ELISA (EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay) jest jedną z najpowszechniejszych metod stosowanych w badaniach diagnostycznych i naukowych.

Jej zadaniem jest wykrycie i oszacowanie stężenia badanego białka poprzez użycie odpowiednich przeciwciał — monoklonalnych lub poliklonalnych. Podstawą metody jest

tworzenie kompleksów antygenprzeciwciało, których wykrycie umożliwia sprzężona reakcja enzymatyczna. Technika została po raz pierwszy opisana przez Petera Perlmana i

Eve Engvall z Uniwersytetu w Sztokholmie w roku 1971 i doczekała się licznych modyfikacji.

Mechanizm działania – krok po kroku

1. Do badania używa się płytek, najczęściej polistyrenowych lub

pleksiglasowych (szkło akrylowe). Każda płyta składa się ze studzienek

(dołków), do których nakładane są próbki antygenu (w testach pośrednich

i bezpośrednich) bądź przeciwciała (w teście kanapkowym i bardziej

złożonych wariantach ELISy). Proces ten nazywany jest opłaszczaniem

fazy stałej i jest niezbędny na początkowym etapie reakcji.

2. Po opłaszczaniu musimy zablokować miejsca niezwiązane z opłaczającym antygenem/przeciwciałem, a niespecyficznie wiążące białka. W tym celu stosujemy czynniki blokujące takie

jak na przykład roztwór owoalbuminy, kazeina (odtłuszczone mleko w proszku), albumina (najczęściej BSA) lub żelatyna.

3. Kolejnym etapem jest dodanie specyficznego dla antygenu przeciwciała lub antygenu (w teście kanapkowym). W tym momencie tworzy się kompleks immunologiczny.

4. By uniknąć niespecyficznego tła reakcji odpłukujemy pozostałe niezwiązane przeciwciała/antygeny.

5. W testach wymagających dodania przeciwciał drugorzędowych wykonujemy kolejną inkubację i odpłukiwanie.

6. Po dodaniu do każdej studzienki odpowiedniego substratu chromogennego dla enzymu, dochodzi do reakcji enzymatycznej, co charakteryzuje się powstaniem barwnego produktu.

Intensywność koloru jest sczytywana spektrofotometrycznie przy odpowiedniej długości fali (obecnie stosuje się automatyczne czytniki) i porównywana z krzywą wzorcową, sporządzaną

dla znanych stężeń antygenu.

elisa 2

ELISA to najpopularniejsza technika immunoenzymatyczna stosowana w diagnostyce i badaniach

naukowych

Znakowanie przeciwciał: do znakowania przeciwciał używa się najczęściej peroksydazy chrzanowej, rzadziej fosfatazy

alkalicznej, oksydazy glukozowej czy betagalaktozydazy. Każdy z tych enzymów katalizuje in vitro przekształcenie

substratu w barwny produkt. Enzymy są koniugowane z przeciwciałem i w tej formie sprzedawane przez producentów.

Sprzęganie może być kowalencyjne (mostki disiarczkowe), poprzez łączniki dekstranowe lub wiązanie streptawidyna

biotyna.

Rodzaje testów

• Bezpośredni test ELISA

jest to bardzo szybka metoda wykrycia obecności antygenu, aczkolwiek droga i dziś prawie już nie stosowana. Z fazą stałą wiązany jest antygen, natomiast specyficzne przeciwciało,

skoniugowane z enzymem znajduje się w roztworze. Konieczność koniugowania z enzymem każdego przeciwciała z osobna spowodowała, że metoda została wyparta przez techniki

pośrednie.

• Pośredni test ELISA

antygen opłaszczający płytkę wykrywany jest przez swoiste, nieznakowane

przeciwciało i tworzy z nim kompleks immunologiczny. W kolejnym etapie

do studzienek dodawane są skoniugowane z enzymem przeciwciała

drugorzędowe, nacelowane na część stałą łańcucha przeciwciała

pierwszorzędowego. Jest to genialne posunięcie, pozwala bowiem na dowolny

dobór przeciwciał drugorzędowych, które są uniwersalne dla organizmu, z

którego pochodzą przeciwciała pierwszorzędowe. Tak więc przeciwciało anty

królicze wykryje każde przeciwciało królicze, a antymysie, każde przeciwciało

mysie. Jest to typowy test ELISA używany w badaniach naukowych oraz w

badaniach jakościowych. Metoda nie grzeszy jednak czułością, dlatego została

udoskonalona w postaci testu typu Sandwich.

• Test kanapkowy (sandwich ELISA)

służy przede wszystkim do wykrywania i ilościowego oznaczania interesującego nas antygenu w diagnostyce medycznej. Tym razem w fazie stałej znajduje się przeciwciało monoklonalne

„zerowego rzędu”. Z nim łączy się antygen, a następnie po jego odpłukaniu używa się przeciwciała pierwszorzędowego — także monoklonalnego,ale nakierowanego na inny epitop badanego

białka. Pozwala to na maksymalne zwiększenie specyficzności reakcji. Zwiększenie czułości zapewnia przeciwciało drugorzędowe, sprzężone z enzymem.

Zalety metody

ELISA jest z pewnością jedną z najważniejszych technik immunoenzymatycznych. Jej zalety to wysoka czułość, duża przepustowość, możliwość półautomatyzacji, a przede wszystkim

wynik ilościowy. ELISA w rutynowej diagnostyce znalazła zastosowanie głównie w mikrobiologii lekarskiej i diagnostyce weterynaryjnej (wykrywanie i monitoring leczenia patogenów),

http://dolinabiotechnologiczna.pl/diagnostykalaboratoryjna2/protokolybadandiagn/labowe%E2%80%9Eknowhow%E2%80%9Delisa/?print=print

1/2

10.03.2015

dolinabiotechnologiczna.pl/diagnostykalaboratoryjna2/protokolybadandiagn/labowe„knowhow”elisa/?print=print

immunologii i serologii (wykrywanie przeciwciał i autoprzeciwciał),

toksykologii, onkologii, a także w przemyśle (typowanie szczepów,

wykrywanie zanieczyszczeń grzybowych produktów spożywczych) i rolnictwie.

Literatura

1. Lequin R (2005), Enzyme

immunoassay (EIA)/enzymelinked

immunosorbent assay (ELISA),

Clin. Chem. 51 (12): 2415–8.

doi:10.1373/clinchem.2005.051532

2. S. Leng, J. McElhaney, J. Walston, D. Xie, N. Fedarko, G. Kuchel

(October 2008). Elisa and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in

Inflammation and Aging Research. J Gerontol a Biol Sci Med Sci 63 (8): 879–

84. PMC 2562869. PMID 18772478.

Paulina KłosWojtczak, Marzena Pieronkiewicz

http://dolinabiotechnologiczna.pl/diagnostykalaboratoryjna2/protokolybadandiagn/labowe%E2%80%9Eknowhow%E2%80%9Delisa/?print=print

2/2

Analityka 5.pdf

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: