alkohol endogenny.pdf

(187 KB) Pobierz

ARCH. MED. SĄD. KRYMINOL., 2013, LXIII, 277-282

PRACE ORYGINALNE / ORIGINAL PAPERS

Małgorzata Kurzejamska-Paraﬁniuk

, Stefania Giedrys-Kalemba

, Zygmunt Sagan

Stanisław Wolski

Bacterial ﬂora in blood samples collected during an autopsy for routine testing

of ethanol concentration

Flora bakteryjna w próbkach krwi rutynowo pobranych do badań

na zawartość etanolu podczas autopsji

Z Zakładu Toksykologii Klinicznej i Sądowej Katedry Medycyny Sądowej

Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie

Kierownik: prof. dr hab. n. med. K. Borowiak

Z Katedry i Zakładu Mikrobiologii i Immunologii

Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie

Kierownik: prof. dr hab. n. med. S. Giedrys-Kalemba

Próbki krwi, pobrane w czasie sekcji zwłok do

rutynowych oznaczeń zawartości etanolu, zabez-

pieczone ﬂuorkiem sodu poddano badaniu mikro-

biologicznemu, na które składała się ocena mikro-

skopowa, posiewy na podłoża różnicująco-namna-

żające, a następnie identyﬁkacja wyhodowanych

szczepów. Stwierdzono, iż dodawany konserwant

nie hamował całkowicie wzrostu bakterii. Z bada-

nych próbek krwi najczęściej izolowano bakterie

Gram-ujemne, wśród których najczęściej występo-

wała

E. coli.

Blood samples collected during autopsy for rou-

tine ethanol testing, preserved with sodium ﬂuoride

were subjected to the following microbiological

tests: microscopic evaluation, cultures on differen-

tiating proliferating media and identiﬁcation of iso-

lated strains. It was found that sodium ﬂuoride did

not entirely inhibit bacterial growth. The majority

of the isolated bacteria were Gram-negative rods,

with

E. coli

as the most frequent strains.

Słowa kluczowe:

alkohol pośmiertny (endogenny);

ﬂuorek sodu; bakterie we krwi post mortem

Key words:

postmortem (endogenic) alcohol;

sodium ﬂuoride; bacteria in

postmortem blood

WSTĘP

Zagadnienie alkoholu pośmiertnego (endogen-

nego), to jest alkoholu wytwarzającego się w zwło-

kach (alkohol endogenny

in corpore)

lub w mate-

riale biologicznym w czasie jego przechowywania

(tzw. alkohol endogenny

in vitro)

[1], jest przed-

miotem badań od kilkudziesięciu lat [2]. Liczne

badania wykazały, iż alkohol endogenny powstaje

w wyniku przemian metabolicznych drobnoustro-

jów [3, 4, 5, 6, 7, 8, 9], których to inwazja

następuje po śmierci. Mogą one pochodzić ze

zwłok, ale mogą też przenikać ze środowiska [10,

11]. Zależy to w dużej mierze od przyczyny zgonu,

rodzaju śmierci, stanu jelit i żołądka, kwasowości

środowiska, miejsca znalezienia zwłok, temperatury

otoczenia a także warunków przechowywania ma-

teriału po pobraniu [12, 13, 14]. W celu stabiliza-

cji poziomu alkoholu we krwi, odpowiadającego

momentowi jej pobrania ze zwłok i zatrzymania

procesów gnilno-rozkładowych, w wyniku których

może powstać alkohol endogenny

in vitro,

dodaje

się do próbki ﬂuorku sodu [4].

CEL PRACY

Celem pracy było sprawdzenie, czy we krwi po-

branej na rutynowe oznaczenie zawartości etanolu,

mimo zabezpieczenia ﬂuorkiem sodu, są obecne

2013 © by Polskie Towarzystwo Medycyny Sądowej i Kryminologii, ISSN 0324-8267

278

Małgorzata Kurzejamska-Paraﬁniuk, Stefania Giedrys-Kalemba, Zygmunt Sagan, Stanisław Wolski

Nr 4

drobnoustroje oraz określenie gatunku wyizolowa-

nych szczepów.

MATERIAŁ I METODY

Materiał do badań stanowiło 50 próbek krwi,

pobranych w czasie sekcji zwłok z żyły udowej na

rutynowe oznaczenie zawartości etanolu. Sekcje

wykonane były w okresie od 2 do 7 dni od momen-

tu zgonu. Krew pobierano podczas sekcji równole-

gle do dwóch szklanych probówek o pojemności

5 ml (BD Vacutainer REF 367764) zawierających

ﬂuorek sodu z heparyną w ilości 20 mg [15]. Pro-

bówki z krwią jak najszybciej umieszczano w nad-

zorowanej lodówce i transportowano do labora-

torium. Jedna służyła do oznaczenia zawartości

etanolu, druga do przeprowadzenia badania mikro-

biologicznego.

Oznaczanie etanolu metodą chromatograﬁi gazowej

Do oznaczenia etanolu pobierano dwie odrębne

próbki krwi o objętości 0,2 ml, dodając do każdej

próbki krwi 0,2 ml roztworu tert-butanolu (2-me-

tylo-2-propanol) o stężeniu 2,0 g/L (2‰). Materiał

był umieszczany w naczyńkach chromatograﬁcz-

nych zamykanych membraną z gumy silikonowej

i aluminiowym kapslem, a następnie był anali-

zowany metodą kapilarnej chromatograﬁi gazowej

z wykorzystaniem techniki analizy fazy nadpo-

wierzchniowej (head space analysis) [16]. Z bada-

nymi próbkami krwi były jednocześnie analizowane

wzorce kalibracyjne alkoholu etylowego oraz próbki

kontrolne, w tym jedna ujemna. Metoda była zwali-

dowana zgodnie z wytycznymi Międzynarodowej

Organizacji Standaryzacyjnej [17].

Aparatura i warunki analizy

Chromatograf gazowy Clarus 500 z autosample-

rem TurboMatrix-40 ﬁrmy Perkin-Elmer, model dwu-

kanałowy wyposażony w dwie kolumny kapilarne

różniące się polarnością (Elite BCA1 oraz Elite BCA2

ﬁrmy Perkin-Elmer, detektor płomieniowo-joniza-

cyjny (FID), temp. kolumny 40

C, temp. dozownika

140

C, temp. detektora 250

C, gaz nośny: hel pod

ciśnieniem 75 kPa, split 3:1.

Odczynniki

- standard wewnętrzny 2 g/L roztworu tert-buta-

nolu

- roztwory wodne alkoholu etylowego o stęże-

niach w zakresie 0,02-5,0 mg/L ﬁrmy MERCK

- gazy: hel, powietrze, wodór o czystości mini-

mum 99,9%.

Badanie mikrobiologiczne

Z każdej próbki krwi wykonywano preparat bar-

wiony metodą Grama oraz posiew na podłoża w kie-

runku drobnoustrojów tlenowych: agar z krwią (nie-

selektywne podłoże wzbogacone), agar MacConkeya

(podłoże wybiórczo-różnicujące pałeczki Gram-ujem-

ne), agar Chapmana (podłoże wybiórczo-różnicują-

ce gronkowce) oraz w kierunku bakterii beztleno-

wych: agar Schaedlera. Podłoża w kierunku bakterii

tlenowych inkubowano najpierw w temp. 35

C przez

24 h w cieplarce, a przez kolejną dobę w temp. po-

kojowej. Podłoża w kierunku bakterii beztlenowych,

bezpośrednio po posiewie wkładano do anaerostatu

z systemem GasPack, następnie inkubowano w cie-

plarce, w temp. 35

C przez 5 dni. Identyﬁkację wy-

rosłych na podłożach drobnoustrojów przeprowa-

dzano zgodnie z rutynowymi procedurami, m.in. na

podstawie wyglądu kolonii, oceny preparatu z ho-

dowli barwionego metodą Grama oraz badania bio-

chemicznego obejmującego proste testy identyﬁka-

cyjne i zestawy biochemiczne typu Api [18, 19].

Wszystkie podłoża zastosowane do posiewów, ze-

stawy GasPack oraz testy identyﬁkacyjne pocho-

dziły z ﬁrmy bioMerieux Polska, badania wykonano

w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii i Immunologii

PUM.

WYNIKI

Dodatnie wyniki badania mikrobiologicznego

uzyskano w 38 z 50 zbadanych próbek krwi, co

stanowi 76%. W pozostałych 12 próbkach nie

stwierdzono w posiewie drobnoustrojów, aczkol-

wiek w każdej badanej próbce krwi w preparacie

bezpośrednim barwionym metodą Grama widoczne

były najczęściej różne formy morfologiczne bakterii

(ziarniaki, pałeczki, laseczki), w różnej ilości, od

pojedynczych komórek do licznych. W nielicznych

próbkach obserwowano pojedyncze komórki droż-

dżaków w formie blastospor. Najwięcej dodatnich

posiewów (20) stwierdzono w próbkach krwi o naj-

niższej zawartości etanolu (0,00-0,5 g/L), nato-

miast wszystkie próbki ze stężeniem etanolu prze-

kraczającym 3,0 g/L (7) były ujemne. Nie wykaza-

2013 © by Polskie Towarzystwo Medycyny Sądowej i Kryminologii, ISSN 0324-8267

Nr 4

FLORA BAKTERYJNA W PRÓBKACH KRWI RUTYNOWO POBRANYCH DO BADAŃ

NA ZAWARTOŚĆ ETANOLU PODCZAS AUTOPSJI

279

no wyraźnych zależności pomiędzy dodatnim/ujem-

nym wynikiem badania mikrobiologicznego oraz

stężeniem alkoholu w próbce z czasem pobrania

próbki krwi od momentu zgonu, który wynosił śred-

nio 4,2 (3,9-4,6) dni. Wyniki przedstawiono w ta-

beli I.

Tabela I. Wyniki badań mikrobiologicznych 50 próbek krwi sekcyjnej w zależności od zawartego w nich

stężenia etanolu.

Table I. Results of microbiological studies in 50 postmortem blood samples depending on blood

ethanol concentration.

Próbki krwi

Blood samples

Zakres stężenia etanolu w próbce (g/L)

Concentration range of ethanol found in the samples (g/L)

0,00-0,50

Posiewy dodatnie

/ Positive cultures

Posiewy ujemne

/ Negative cultures

Razem

/ Total

Średni czas pobrania od zgonu

Mean interval between sample

collection and death

4,3

0,50-0,99

4,6

1,00-1,99

4,1

2,00-2,99

3,9

> 3,00

4,2

38 (76,0%)

12 (24,0%)

50 (100%)

4,2

Razem

Total

Z dodatnich próbek krwi zwykle izolowano mie-

szaną ﬂorę bakteryjną, od 2 do 5 szczepów z jed-

nej, co w większości pokrywało się z oceną pre-

paratu bezpośredniego. Z żadnej nie wyhodowano

grzybów. Ogółem wyizolowano 84 szczepy bakterii.

Najczęściej były to pałeczki Gram-ujemne (71,4%),

rzadziej ziarenkowce Gram-dodatnie (20,2%). Więk-

szość wyhodowanych pałeczek Gram-ujemnych na-

leżała do rodziny

Enterobacteriaceae

(46 z 60 szcze-

pów). Wśród nich najczęściej izolowano

Escherichia

coli

(20,2% wszystkich izolatów),

Klebsiella pneu-

moniae, Citrobacter freundii

Proteus

spp. (po

9,5%). Za pomocą dostępnych testów nie udało się

zidentyﬁkować 12 (14,3%) szczepów pałeczek

Gram-ujemnych. Wśród ziarenkowców Gram-do-

datnich najczęściej izolowano

Enterococcus faeca-

lis

(14,3%) i

Staphylococcus epidermidis

(5,9%).

Z pojedynczych próbek izolowano tlenowe laseczki

z rodzaju

Bacillus

(2 szczepy), tlenowe maczugow-

Corynebacterium pseudodiphtheriae

(3) i w 2

próbkach bakterie beztlenowe z rodzaju

Peptostre-

ptococcus.

Najwięcej bakterii, szczególnie pałeczek

Gram-ujemnych, stwierdzono w próbkach krwi o naj-

niższych zawartościach etanolu od 0,00-0,5 g/L –

29 szczepów, w próbkach o stężeniu etanolu od

0,5-1,0 g/L – 27 szczepów. Szczegółowe wyniki

badań mikrobiologicznych próbek krwi w zależności

od zawartego w nich etanolu przedstawiono w ta-

beli II.

OMÓWIENIE WYNIKÓW

Wiele drobnoustrojów kolonizujących organizm

człowieka za życia oraz ulegających translokacji ze

środowiska do zwłok po śmierci może tworzyć alko-

hol endogenny w krwi sekcyjnej, a także w trakcie

przechowywania próbki krwi do badań na rutynowe

oznaczenie zawartości etanolu. Należy do nich ok.

60 gatunków bakterii, ok. 20 gatunków drożdża-

ków i ok. 25 gatunków pleśni [1, 2, 5]. W celu za-

hamowania wzrostu mikroorganizmów do krwi sek-

cyjnej dodawany jest ﬂuorek sodu, szeroko stoso-

wany jako środek bakteriobójczy i dezynfekcyjny.

W konsekwencji ma on zabezpieczyć krew przed

dalszą fermentacją rozkładową i wytworzeniem

alkoholu endogennego [4, 15].

W badaniach własnych oceniano obecność drob-

noustrojów w 50 próbkach krwi, pobranych na ru-

tynowe oznaczenie zawartości etanolu do probówek

z dodatkiem ﬂuorku sodu. We wszystkich próbkach

2013 © by Polskie Towarzystwo Medycyny Sądowej i Kryminologii, ISSN 0324-8267

280

Małgorzata Kurzejamska-Paraﬁniuk, Stefania Giedrys-Kalemba, Zygmunt Sagan, Stanisław Wolski

Nr 4

Tabela II. Gatunki bakterii izolowane z próbek krwi sekcyjnej w zależności od zawartego w nich

stężenia etanolu.

Table II. Bacteria species isolated from postmortem blood samples depending on blood ethanol

concentration.

Bakterie

Bacteria

Liczba

szczepów (%)

Number

of strains (%)

60 (71,4)

17 (20,2)

8 (9,5)

4 (4,8)

2 (2,4)

1 (1,2)

12 (14,3)

17 (20,2)

5 (5,9)

1 (1,2)

10 (14,3)

1 (1,2)

7 (8,4)

2 (2,4)

3 (3,6)

2 (2,4)

84 (100)

Zakres stężeń etanolu zawartego w próbkach (g/L)

Concentration range of ethanol found in the samples (g/L)

0,00-0,50

0,50-0,99

1,00-1,99

2,00-2,99

> 3,00

Pałeczki Gram-ujemne

Gram-negative rods

Escherichia coli

Citrobacter freundii

Klebsiella pneumoniae

Proteus

spp.

Hafnia alvei

Pasteurella aerogenes

Serratia liquefaciens

Niezidentyﬁkowane

/ Unidentiﬁed

Ziarenkowce Gram-dodatnie

Gram-positive cocci

Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus aerogenes

Enterococcus faecalis

Streptococcus pyogenes A

Inne

/ Others

Bacillus

spp.

Corynebacterium pseudodiphtheriae

Peptostreptococcus

spp.

Razem

/ Total

w preparacie bezpośrednim barwionym metodą

Grama obserwowano pojedyncze lub liczne formy

morfologiczne różnych mikroorganizmów, zaś do-

datnie wyniki posiewu w kierunku bakterii tleno-

wych i beztlenowych stwierdzono w 76%, częściej

w próbkach krwi o niższych zawartościach etanolu.

Wszystkie próbki ze stężeniem etanolu powyżej

3,0 g/L były mikrobiologicznie ujemne. Nie wy-

kazano jednak wyraźnych zależności pomiędzy do-

datnim/ujemnym wynikiem badania mikrobiolo-

gicznego oraz stężeniem alkoholu w próbce z cza-

sem pobrania próbki krwi od momentu zgonu, który

średnio wynosił 4,2 dni.

Większość drobnoustrojów wyizolowanych z pró-

bek krwi stanowiły bakterie tlenowe (97,6%), wśród

których największy odsetek stanowiły pałeczki Gram-

-ujemne (71,4%). Najliczniej występowały

E. coli

(20,2%) oraz

Klebsiella pneumoniae, Citrobacter

Nr 4

FLORA BAKTERYJNA W PRÓBKACH KRWI RUTYNOWO POBRANYCH DO BADAŃ

NA ZAWARTOŚĆ ETANOLU PODCZAS AUTOPSJI

281

freundii

Proteus

spp. (po 9,5%). Bakterie te, nale-

żące do rodziny

Enterobacteriacae,

wchodzą w skład

ﬂory ﬁzjologicznej przewodu pokarmowego czło-

wieka, a tym samym, jako pierwsze ulegają translo-

kacji po całym organizmie po śmierci [19]. Obec-

ność ich w próbkach krwi sekcyjnej jest więc głów-

nie pochodzenia endogennego, rzadziej egzogen-

nego. Z kolei pałeczki Gram-ujemne, których nie

udało się zidentyﬁkować w badaniach własnych

(14,3%) oraz

Pasteurella aerogoenes

wskazują na

obecność w krwi także bakterii egzogennych, po-

chodzących ze środowiska.

Pałeczki z rodziny

Enterobacteriaceae,

należące

do bakterii względnie beztlenowych, mogą oddy-

chać zarówno w warunkach tlenowych jak i beztle-

nowych. W warunkach beztlenowych produktami

metabolizmu są alkohol etylowy i kwas octowy.

Gatunek

E. coli

może ze 100 moli glukozy wypro-

dukować 49,8 mola etanolu [5, 7]. Bakterie te

należą do najczęściej izolowanych z kału od osób

zdrowych, jak również najliczniej występowały

w badanych próbkach krwi sekcyjnej z dodatkiem

ﬂuorku sodu. Należy więc sądzić, że

E. coli

wraz

z innymi bakteriami Gram-ujemnymi może być

szczególnie odpowiedzialna za powstawanie alko-

holu endogennego w próbkach krwi sekcyjnej, ru-

tynowo pobieranych do badań na obecność eta-

nolu, w warunkach zastosowania ﬂuorku sodu.

Zdolność

E. coli

do produkcji etanolu wykorzysty-

wana jest także w badaniach doświadczalnych

zmierzających do opracowania prostego modelu

matematycznego, który byłby w stanie w przybliże-

niu określić ilość alkoholu endogennego wytwarza-

nego przez drobnoustroje w krwi w powiązaniu z in-

nymi wytworzonymi/obecnymi alkoholami [21, 22].

Ziarenkowce Gram-dodatnie stanowiły 20,2%,

wyizolowanych bakterii, w tym najczęściej był to

Enterococcus faecalis,

gatunek również powszech-

nie kolonizujący przewód pokarmowy człowieka i in-

nych ssaków [19]. Gatunek ten wytwarza jednak

niewielkie ilości etanolu [22].

Żródłem etanolu endogennego mogą być rów-

nież bakterie beztlenowe oraz grzyby. Jak wynika

z badań Olszewskiej [14], odsetek w krwi sekcyjnej

bakterii beztlenowych może wynosić 27%; nie sto-

sowała ona jednak ﬂuorku sodu. Wśród bakterii bez-

tlenowych najczęściej wymienia się laseczki z rodza-

Clostridium

[21, 22]. W badaniach własnych

izolowano jedynie 2 (2,4%) szczepy beztlenowych

paciorkowców z rodzaju

Peptostreptococcus,

nie

stwierdzono natomiast żadnej kolonii drożdżaków

i grzybów pleśniowych. Nie można wykluczyć, że

niewielkie ilości grzybów w próbce krwi (widoczne

były pojedyncze komórki drożdżaków w preparacie

bezpośrednim) mogły zostać zahamowane poprzez

dodanie ﬂuorku sodu.

Pewne działanie hamujące wzrost bakterii może

mieć także wysokie stężenie etanolu obecnego

w próbkach krwi sekcyjnej. Wskazują na to nasze

badania, gdzie wszystkie badane próbki krwi zawie-

rające powyżej 3 g/L były mikrobiologicznie ujem-

ne, aczkolwiek Olszewska [14] uważa, że alkohol

etylowy obecny w próbce, nawet > 4 g/L nie ha-

muje rozwoju ﬂory bakteryjnej.

WNIOSKI

1. Fluorek sodowy, dodawany jako środek bak-

teriobójczy do próbek krwi sekcyjnej badanych na

zawartość etanolu, nie hamuje całkowicie wzrostu

bakterii, zwłaszcza w próbkach zawierających niż-

sze stężenia etanolu.

2. Z badanych próbek krwi sekcyjnej zabezpie-

czonej ﬂuorkiem sodu najczęściej izolowano bakte-

rie Gram-ujemne, wśród których najliczniej wystę-

pował gatunek

Escherichia coli.

3. Wysokie stężenie etanolu powyżej 3,0 g/L

obecnego w próbce krwi z dodatkiem ﬂuorku sodu

jest dodatkowym czynnikiem hamującym wzrost

bakterii.

PIŚMIENNICTWO

1. Pragłowski T., Nasiłowski W., Sybirska H.:

Badania nad powstaniem alkoholu endogennego

w zwłokach ludzkich. Arch. Med. Sąd. Kryminol.

1968, 18 (1): 61-65.

2. Osterhaus E., Johansmeier K.: Postmortale

Entstchung von Alkoholen durch Faulnis. Dtsch.

Z. Gesamt. Gerichtl. Med. 1996, 57: 281-284.

3. Daves E. A., Foster S. M.: The formation on

ethanol in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta,

1956, 22: 253-259.

Plik z chomika:

Clara_Oswald

Inne pliki z tego folderu:

John Corsellis boks i mózg.pdf (2676 KB)
alkohol endogenny.pdf (187 KB)
death.pdf (320 KB)
kosci ludzkie i zwierzece.pdf (2110 KB)
materiał biologiczny.pdf (1939 KB)

alkohol endogenny.pdf

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: