AM_Barwienia_Histochemia.pdf

(2498 KB) Pobierz
Struktury histologiczne są optycznie obiektami fazowymi
– nie zmieniają ani amplitudy fali
światła
(obiekty nie są
ciemniejsze ani jaśniejsze), ani jej długości (barwa), a
jedynie powodują załamanie
światła
i przesunięcie fazy …
Techniki histologiczne –
barwienie
… oko ludzkie nie jest w stanie zarejestrować tej zmiany –
stąd konieczność uwidocznienia struktur.
W technikach mikroskopowych jest to realizowane przez
barwienie
preparatów.
Stosując różne techniki barwienia jesteśmy w stanie
uwidocznić odmienne składniki komórkowe lub tkankowe
Cząsteczka barwnika posiada:
grupę chwytną
grupę barwną
Większość metod barwienia oparta jest na chemicznym
wiązaniu cząsteczki barwnika ze składnikami tkankowymi.
Łączenie barwnika z substratem tkankowym najczęściej oparte
jest na tworzeniu różnorodnych oddziaływań chemicznych:
- oddziaływania elektrostatyczne
- wiązania kowalencyjne
- oddziaływania van der Waalsa
- wiązania wodorowe
Czasami występuje konieczność wcześniejszej modyfikacji
chemicznej tkanek, co dopiero umożliwia wiązanie cząsteczki
barwnika – taki proces nazywa się
bejcowaniem
W zależności od zdolności wiązania barwnika z określonymi
strukturami mówimy o swoistości barwienia. Barwienia
histologiczne (strukturalne) cechują się raczej niewielką
swoistością.
błękit alcjanowy
łę
kit
Wybrane metody barwienia
Barwienie rutynowe –
hematoksylina
i
eozyna
Rodzaje hematoksylin
–
najczęściej stosowane: hemalauny
–
konieczność utlenienia hematoksyliny
–
barwienie progresywne / regresywne
H. campechianum
Delafield
Bejca
Ałun
amonowo-
glinowy
Światło
i
powietrze
95% alkohol
Mayer
Ałun
potasowo-
glinowy
Jodan
sodowy
Kwas
cytrynowy
Ehrlich
Ałun
potasowo-
glinowy
Tlen
z powietrza
Glicerol,
kwas octowy
Weigert
Chlorek
żelaza
Utlenianie
Chlorek
żelaza
Kwas solny
Roztwór
Dodatkowo
Woda
Wodzian
chloralu
95% alkohol
95% alkohol
1
Barwienia trójbarwne (np. AZAN)
Impregnacja solami srebra
– np. włókna srebrochłonne
Barwienia rozmazów i wymazów
Giemsa / May Grünwald
Papanicolau
Przygotowanie skrawków do barwienia HE:
•
odparafinowanie (ksylen)
•
nawodnienie (alkohol etylowy)
•
barwienie w hematoksylinie
•
płukanie (woda bieżąca –
– zmiana koloru hematoksyliny)
•
barwienie w eozynie
•
płukanie (krótko)
Zamykanie:
•
odwadnianie (alkohol)
•
prześwietlanie (ksylen)
•
zamykanie w
żywicy
Barwienia histochemiczne
Cel barwienia: wykazanie obecności konkretnych
substancji chemicznych i określenie ich lokalizacji
tkankowej
Dużo większa swoistość niż barwień strukturalnych
Wykonanie na materiale histologicznym reakcji
chemicznej, w wyniku której powstaje produkt:
-
barwny lub kontrastowy
(elektronowo gęsty, fluoryzujący)
-
nierozpuszczalny w
środowisku
reakcji
Rodzaje rekacji histochemicznych
-
reakcje jednoetapowe
-
reakcje wieloetapowe
-
wiązanie elektrostatyczne
-
reakcje stereospecyficzne
-
reakcje fizyczne oparte na różnicy
rozpuszczalności barwnika (barwienie lipidów)
Reakcja Feulgena –
reakcja dwuetapowa
1. hydroliza w HCl
2. reakcja z odcz.
Schiffa
tu: dod. podbarwienie
cytoplazmy zielenią
jasną
2
Przykłady reakcji histochemicznych
Reakcja Feulgena - DNA
Hoechst - DNA (met. fluorescencyjna)
Pyronina - RNA (met. Bracheta)
PAS – polisacharydy obojętne
Błękit alcjanowy – polisacharydy kwaśne
Błękit toluidynowy – polisacharydy kwaśne
(barwienie metachromatyczne)
3
Sudan III
(barwienie lipidów, reakcja fizyczna)
Błękit pruski –
żelazo
Czerwień alizarynowa – złogi wapniowe
Czerwień Kongo – złogi amyloidu
Barwienia histoenzymatyczne
Wykazanie aktywności konkretnych enzymów
ENZYM
SUBSTRAT
PRODUKT
Fosfataza kwaśna
(enzym lizosomalny) - makrofagi
Warunki przeprowadzenia reakcji:
- enzym musi być czynny (utrwalanie, zatapianie
może go inaktywować)
- inkubacja przeprowadzana w warunkach
optymalnych dla działania enzymu
Niektóre z enzymów są charakterystyczne dla
wybranych organelli lub komórek, dlatego metody
histoenzymatyczne mogą być stosowane do ich
identyfikacji
4
Rekacje histochemiczne – uwagi:
•
Podbarwienie tła
•
Reakcje kontrolne
•
Czułość metody
•
Ocena ilościowa
5

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin