Streszczenie 133-142.doc

TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog

Strony 133-142

mRNA nie może być wykorzystuwane jako materiał dla wektorów, jednakże może być przekształcone do cDNA, komplementarnego DNA, które jak najbardziej może stanowić materiał do biblioteki klonów. Kluczem jest uzycie odwrotnej transkryptazy, która syntetyzuje DNA korzystając z matrycy jaką jest mRNA. Po utworzeniu hybrydy mRNA-DNA przez odwrotną transkryptazę, nić mRNA jest degradowana czesciowo przez Rnazę I, a pozostajace fragmenty stanowią premiery dla polimerazy DNA I, która sytnetyzuje drugą nić. W ten sposób powstaje dupleks DNA, zlozny z nici cDNA powstałej dzięki odwrotnej transkryptazie i nici DNA powstalej przez replikacje polimerazą DNA I, z użyciem primerów, którymi były resztki niestrawionego mRNA. Rezultatem jest dwuciniowe DNA reprezentujace zapis genów z mRNA, które tak jak każde DNA może być użyte do klonwania z wektorami.

Użycie klonów cDNA i powstawanie samego cDNA:

8.4 Metody identyfikacji klonów z biblioteki

Kiedy dysponujemy odpowiednia biblioteką klonów, musimy zastanowić się nad metodami identyfikacji klonów. Kilka z nich opartych jest na detekcji produktów białkowych klonowanych genów, lecz wiekszosc opiera się na prostszym mechanizmie wykrywania rekombinantów poprzez sondy hybrydyzacyjne.

Każde dwunicowe cząsteczki kwasu nukleinowego są zdolne do formowania wiazan miedzy soba, jelsi tylko wystepuja miedzy nimi komplementarnośc zasad. Rezltatem takiego parowania jesy hybryda w której jedna z nici pochodzi z biblioteki genów, a druga to nasza sonda hybrydyazcyjna., Zwiazanie się ich nazywamy hybrydyzacją i stanowi ono dla nas sygnał ze w danym miejscu znajduje się szukana przez nas sekwencja kwasu nukleinowego. Mówimy kwasu nukleinowego, ponieważ ta hybrydyzacja może zacohdzic nie tylko miedzy dwiema nicmi DNA, ale także miedzy dwiema nicmi RNA, lub miedzy nicia RNA i DNA.

Zatem jelsi dysponujemy odpwoeidnia sondą hybrydyacyjna, latwo możemy odszukac pożądany przez nas gen z szerokiej ilości klonów w bibliotece.

Sondy mogą być używane do szukanai zarówno na płyktach z transformowanymi koloniami bakterii jak i na płytkach z łysinkami wytworzonymi przez bakteriofagi, które zostąły przeniesione na nylonową lub celulozową błonę i oczyszcozne z przeszkadzajacych substancji, pozostawaiajac samo DNA. Takie traktowanie zwykle również prowadzi do denturacji DNA i rozdzeilnia dwuniciowych dupleksow na pojedyncze nici, które z jednej strony są przytwierdozne rdzeniem cukrowym do nylonowej membrany, a zdrugiej są w pleni gotowe na hybrydyzacje z komplementarna sondą. Przytiwerdzenei do membrany nylnoowej odbywa się także dzięki radiacji ultrafiloetowej, a celulozowej poprzez podgrzanie do 80 C.

Hybrydyzacja kwasów nukleinowych:

Sonda musi być teraz oznakowana substancją radioaktywną, zdenaturowana przez podgrzanie i nałożona na membrane w postaci roztworu. Po pewnym czasie membrana jest przemywana, aby usunac niezhybrydyzowane sondy, suszona i poddawana detekcji pod katem sygnałów radioaktywnych. Ujawniają się one na autoradiogramie.

Oto cały proces hybrydyzacji z sondami:

Znakowanie sondy:

Cząsteczki DNA są zazwyczaj znakowane przez radioaktywny izotop fosforu, 32P, istnieje kilka metod użycia go:

-Odczytywanie luk(8.11a). Wiekszosc oczyszczonego DNA zawiera w sobie cząsteczki z lukami na jednej z nici. Jeśli przperowadzimy ostroznie ten proces, polimeraza DNA I, jest w stanie wypelnic te luki. Potrzebuje ona do tego nukletoydów(dNTP), jesli zaznakujemy je, wowczas cząsteczka poddawana działaniu polimerazy będzia zaznakowana. Można tego sposobu użyć do każdej molekuły DNA, lecz w pewnych okolicznosciach może to skutkowac zniszczeniem DNA.

-Wypełnianie końców(8.11b). Jest to subtelniejsza wrsja poprzedniego procesu, w którym uzywamy polimerazy Klenowa do wypelnienia końca cząsteczki DNA, która ma lepki koniec. Ponownie dodanie znakowanych radioizotopowo dNTPów spowoduje wyznakowanie całego DNA.

-Losowe primerowanie(8.11c).Uzywane jest gdy sonda wykazuje duza aktywność, dodawany jest od niej zsetaw heksanukleotydowych losowych sekwencji, które przy odrobinie szczescia powiaza się z nicią DNA sondy. Powstałe dupleksy będą oczywiście zawierać luki, które wypleni polimeraza Klenowa, która nie ma aktywnosci nukleazowej tak jak polimeraza DNA I i nie usunie owych heskanukleotydów. Jelsi do mieszaniny dodamy ponownie wyznakowane dNTPy to fragment Klenowa ktroy będzie ich uzywał wyznakuje nam całą cząsteczkę.

Znakowanie:

Struktura DNA wyznakowanego, radioaktywny fosofor przylacza się w pozycję alfa i stąd cała wyznakowana czastka nosi nazwe ([α-32P]dATP):

Po hybrydyzacji, lokalizacja oznakowanych hybryd, jest wykonywana poprzez autoradiografię, na kliszach.

Nieradioaktywne znaczniki

Ze względu na szkodliwsoc substancji radioaktywnosc, ich zły wpływ na DNA oraz trudnosci z zagospodarowaniem odpadkow radioaktywnych, ostatni ozaczeto uzywac innych znaczników. Pierwszy jest mieszaniną dUTP i biotyny, która wykazuje powinowactwo do białka awidyny. Po hybrydyazji sondy zbiotynylowane śa wyklrywane poprzez przemycie ich awidyną znakowaną fluorescencyjnie. Ta metoda jest dosc czuła i rośnie rzesza jej fanów.

Druga metoda wykorzystuje sondy powiazane z enzymem peroksydazą chrzanową, która wykazuje silne powinowactwo do degradacji substancji fluorescencyjnej – luminolu. Ta degradacja wywoluje implus swiatla, zwany chemiluminescencją, który może być zarejestrowany na kliszy fotograficznej.

Nieradioaktywne znakowanie:

Sukces metod hybrydyzacyjnych zlaezy oczywiście od dostpenosci sond, które musza dzileic sekwencje z szukanymi przez nas klonami genów. Jeśli w ogole nie znamy sekwencji szukanego przez nas genu, to jak skonstruować dla niego sondę? Musimy wykorzystać inne informacje na teamt naszego genu:

-jego zdolnosc od ekspresji w określonym typie komórek, która przyda się w identyfakcji poprzez biblioteke cDNA.

-sekwencje aminokwasową jego produktu białkowego

-jego powiazania z innymi genami.

Sondy do analizy biblioteki cDNA:

Jak wspominalismy wczesniej biblioteka cDNA jest przygotowana z klonów genów, które charakteryzuja się wysokim poziomem ekspresji w okreslonych typach komórek. Przykladem jaki uzylismy była biblioteka genów kodujacych gliadynę. Identyifukacja genów koduajcych gliadyne z takiej biblioteki polega na wykorzsytaniu jednego z klonw z tej biblioteki jako sondy. Taki klon jesto czyszczany, znakowany i sluzy przeszukania pozostalych czlonkow biblioteki. Proces jest powtarzany z roznymi klonami, aż ktorys z nich zhybrydzuje z duza iloscia klonów bibliotece. Te klony są potencjalnymi klonami genów gliadyny, które mogą być poddane wnikliwym badaniom.

Przeszukiwanie biblioteki klonów:

Sondy dla genów kodujacych znane nam białka:

Niektóre geny choc niezane, mogą produkowac białka, których sekwencja aminokwasowa jest dobrze poznana. Ten fakt można wykorzystać do stowrzenia odpoweidniej sondy.

Jeśli sekwencja aminokwasowa jest znana, jest molziwe przewidizenie sekwencji genu, poslugujujac się tablica kodu genetycznego. Jednak pamietajac o zdegenrowaniu kodu genetycznego, kilka aminokwasów może być kodowanych przez wiecej niż jeden kodon, np. alanina może być kodowana przez GCA, GCC, GCG, GCT. Oznacza to ze istniej kilka wariantósekwencji genu w oparciu o znnaa sekwencje aminokwasową. Aby wyjasnioc ten problem posluzym się przykladem cytochromu c – fragment jego skewencji poczynajac od 59 aminokwasu ma kolejnosc, Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met, co przeklada się na sekwencje genu:TGG-GATC-GAAG-AATC- AATC-ATG. Jak widac daje to aż 16 roznych wersji tej skewencji, aczkowliek w każdej 14 z 18 nukleotydow jest pewne co do sowich pozycji, a watpliwosci dotycza tylko czterech.

Omawiany fragment genu cytochromu c:

Ponieważ można altwo oligonuklotydy aż do 150 członów zsyntetyozwac, dlatego wykonuje się sondy, które odpowiadaja wszystkim wersjom tej sekwencji. Na rysunku 8.15 schemat syntezy oligonukleotydu:

W naszym przykladzie wszystkie 16 sond, opowiadajacych wszystkim wersjom nanosimy razem na płytkę, i czekamy aż jeden z nich , ten własciwy zhybrydyzuje z naszym poszukiwanym klonem w bibliotece. Rezultaat może być sprawdozny porpzez dodanie drugiego zestawu sond komplenetarnego do innego fragmentu genu. Ta druga seria mzoe potwierdzic nasze przypuszczenia co do konkretnego klonu, jelsi pierwsza dala kilka sygnalow hybrydyzacyjnych.

Opis tego eksperymentu:

Sondy heterologiczne dla genów spokrewnionych:

Gdy mamy informacje co od funkcji genu, lub znamy czesciowo jego pochodzenei możemy wykonac sondę w oparciu o sekwencje genów familiarnyhc, wykazujacych podobienstwo. Choc taka sonde może nie być w 100% komplemnetarna, istniej duza szansa ze utworzy stabilna hybrydę z naszym klonem, dzięki parowaniu części zasad. Sonodwanei hetrologiczne, może być uzyte gdy znamy skewencje innych blizniacych genówe, i tutaj znów można się posluzyc przykladem cytochormu c, którego klon można odkryć w ibiliotece, poslugujac się osnda stworozną w oparciu o sekwencje tego genu w innych organizmach i przypuszczenie ze w naszym badanym będzie ona dosc pdoobna. I w isttocie sonda z neurospora crassa, gryba, hybrydyzuje z klonem pocohdzacym z drożdzy. Sondowanie heterologiczne również ma zasotoswanie do wykrycia podobnych genów w jednym organizmie. Pnoownie się posluzymy przykladem genu gliadyny, który należy do ordziny genów. Jeśli użyjemy sondy opartej o gen z tej multigenowej rodizny, również powinien on nam wykryc gliadyne.

Sondowanie heterologiczne:

Hybrydyzacja southerna pozwala odkryć specyficzne miejsce restrykcyjne w genie

Poza odkryciem klonu naszego genu, już po tym wydarzeniu, ważne jest aby zlokalizowac w nim wszystkie miejsca restrykcyjne, co pozwlaa przewidizec przebieg eksperymentu klonowania i zastosowanie odpowiedniej restryktazy. Wracajac do cytochromu c klon zawierajacy ten , znajdujacy się w kosmidize ma około 40 kb. Z drugiej strony sam nasz gen cytochormy ma dlugosc ledwie 309 par zasad, co stanowi 1% wielkości klonu.Co widac an rysunku:

              Aby nie badac całego insertu, wraz z innymi genami, które mzoe on zaiwerac istotne jest zlokalizowanie miejsc restrykcyjnych przyleglych do naszego krotkiego genu. Dzięki temu mamy pewnosc ze w pozniejszych eksperymentach wytniemy tylko jego, a nie inne geny, lub niepotrzebnie duzą cześć, która by nas nie interesowała. Metoda Southern blotting pozwlaa odkryć te pojedynczem iejsca restrykcyjne bezposrednio przy naszym krotkim genie.

Southern blotting(hybrydyzacja southerna):