TWÓJ BIOTECHNOLOG https://www.facebook.com/twoj.biotechnolog
Gene cloning & dna analysis (klonowanie genów i analiza dna)
1.1 Wczesny rozwój genetyki
W połowie 19 wieku Grzegorz Mednel sformułował zespół zasad wyjaśniających, na czym polega dziedziczenie cech biologicznych. Podstawowa cechą tych praw jest to, że każdy organizm jest kontrolowany przez czynnik zwany genem, które jest fizycznie obecny gdzieś w komórce. Prawa mendla powstałe w 1900 roku miały na celu zrozumienie, czym są geny i jak one pracują.
Idea, że geny ulokowane są w chromosomach została zaproponowana w 1903 roku przez Suttona i potwierdzona eksperymentalnie w 1910 przez Morgana. Morgan i jego koledzy rozwinęli technikę mapowania genów a w 1922 roku przedstawili analizę ulokowania 2000 genów w 4 chromosomach drosophila melanogaster. Mimo tych badań aż do lat 40. nie ma naukowych dowodów co do molekularnej natury genów. Az do odkryć MacLeoda, Mcartego i Averyego w 1944 roku, i Hersheya oraz Chasea w 1952 nie wierzono ze to DNA jest nośnikiem materiału genetycznego. Sadzono że geny złożone są z białek. W ciągu 14 lat 52-66 struktura Dna została zbadana, opisano procesy transkrypcji a także złamano kod genetyczny.
1.2 Odkrycie klonowania genów i PCR
Nowa generacja biologów molekularnych wciąż niezadowolona była z dotychczasowych osiągnie technicznych i badawczych i aż do późnych lat 60. nie poznano dokładnych technik służących do badania genów. Lata 71-73 można uznać jako okres niezwykle szybkiego rozwoju badań nad genami.
Okryto wówczas wiele metod wykonano eksperymentu które dotychczas były tylko na kartce, i to z sukcesem. Te metody określane wspólna nazwa technologia rekombinacji DNA lub inżyniera genetyczna dały wstęp do klonowania genów i początek złotej erze genetyki. Zapoczątkowały one szybkie i skuteczne sekwencjonowanie DNA i pozwoliły poznać genom człowieka który został skompletowany w roku 2000. Bodźcem do tych badań była chęć poznają jak geny mogą być przyczynami groźnych chorób zwłaszcza raka. Jak również dzięki tym badaniom zrodziła się biotechnologia, gdzie chciano wykorzystać posiadana wiedze o genach do produkcji białek i innych komponentów w procesach przemysłowych. W 1980 roku było jasne że istnieje potrzeba takiej techniki które stanie na wysokości zadań jakie postawiono przed genetyką. Kary Mullis w 1985 odkryła PCR. Arche genetyka, ekologia molekularna, DNA kryminalne były nowymi dziedzinami które mogły się rozwinąć dzięki PCR. Mogły one dać odpowiedzi na temat ewolucji człowieka oraz na to jaki wpływ mają zmiany środowiska na biosferę.
1.3 Czym jest klonowanie?
-fragment DNA zawierający pożądany klon jest wprowadzany do kolistej cząsteczki zwanej wektorem, aby otrzymać zrekombinowaną cząsteczkę DNA.
-wektor transportowany jest do komórek gospodarza którym jest zazwyczaj bakteria
-w procesie replikacji produkowane są setki kopii wektora
-kiedy komórki się dzielą przechowują one kpie początków tylko jednego wektora
-po wielu pędzlach powstaje kolonia, która nazywamy klonem, zawiera one niezliczona ilość kopii komórek gospodarza które przyjęły pierwotny wektor. Każda taka komórka nazywana jest klonem.
Konstrukcja rekombinowanych cząstek DNA:
1.4 Czym jest PCR?
PCR czyli łańcuchowa reakcja polimeryzacji, w odróżnieniu od knowania genów nie jest prowadzona z udziałem żywych organizmów. W probówce znajduje się DNA oraz zmieszane ze sobą reagenty, które poddawane rożnym temperaturom, w serii cyklicznych procesów dają efekt multiplikacji początkowej ilości materiału genetycznego.
-mieszanina jest podgrzewana do 94 C i rozdzielane są dupleksy DNA (denaturacja DNA)
-jest chłodzona do 50-601 C aby przyłączyły się do jednoniciowych końców premiery
-temperatura rośnie do 74 C, jest to optymalne ciepło dla polimerazy Taq która prowadzi syntezę nowych odcinków dna rozpoczynaj się od primerow. Mamy zatem 4 nici zamiast dwóch początkowych.
-rozpoczyna się drugi cykl, temperatura rośnie znów do 94 C, dupleksy zbożne z nic początkowych i tych zsyntetyzowanych znów się rozdzielają do pojedynczych nici. Po drugim cyklu mamy razem 8 nici DNA, które na początku kolejnego cyklu ponownie są rozdzielne po pojedynczych nici. Po okól 30 cyklach mamy około 130 milionów cząsteczek DNA.
Na rysunku poniżej opis wszystkich etapów PCR
1.5 Dlaczego klonowanie genów jest takie ważne?
Kluczem do sukcesu w badaniach nad genami jest odróżnienie jednego klonu od innych cząstek jakie mogą się znajdować. PCR jest użyteczne do tego aby z górna wielu genów wybrać ten właściwy, a zatem PCR jest idealną metodą do oczyszczania próbki w której jest wiele genów. Jeśli rozważymy genom E. Coli który zawiera około 4000 genów kluczowe wydaje się być rozpoznanie tego jednego kluczowego genu. Przypomnijmy ze i tka bakterie są stosunkowo prostymi orgazmami i nie maja tak wiele genów jak choćby ssaki. Różne strategie są wykorzystywane do rozpoznawania określonego genu. Niektóre prowadza od tego ze tylko zrekombinowane korki mogą się cielec, inne prowadza do selekcji w oparciu o wygląd sklonowanych komórek. PCR może służyć do otrzymania czystej próbki genu ze względu na samo miejsce przyłączenia primerow, które można tak skonstruować aby leczyły precyzyjnie w tym miejscu DNA, aby amplifikowany był tylko intersujący nas region materiału genetycznego. Eksperyment PCR trwa kilka godzin, podczas gdy klinowanie zajmuje wiele tygodni aby otrzymać efektywne analizy, dlaczego wiec wciąż jest używane? Dlatego ze PCR ma 2 podstawowe ograniczenia:
-sekwencja intersującego nas odcinka musi być znana aby skonstruować primer
-istniej ograniczenie ilościowe odcinka, który można powielić, łatwo można powielać fragmenty tylko do 5 kb., Podczas gdy intersujące nas geny maja nawet do 40 kb długości.
Izolacja genu przez PCR
Problem selekcji właściwego genu
Wklinowywanie fragmentów DNA do wektorów i wprowadzanie ich do bakterii
Z powodu tych ograniczeń to klonowanie jest używanie zamiast PCR do badania genów o nieznanych sekwencjach. Mimo to PCR jest nadal przydatne w wielu aplikacjach, na przykład nawet jeśli sekwencja genu nie jest znana to nadal można skonstruować primer oparty o inny organizm np. myszy aby zbadać gen człowieka o nieznanej sekwencji. Poza tym PCR jest użyteczne w technikach które maja na celu wyodrębnienie konkretnego genu, np. gen mioglobiny ludzkiej ma poznana sekwencje, i PCR jest w tym przypadku w 100% efektywne, po PCR gen mioglobiny można badać np. pod katem obecności mutacji, które mogą prowadzić do różnych chorób. Innym zastosowaniem jest użycie PCR do wykrywania chorób wirusowych, w tym przypadku premiery są komplementarne do określonych sekwencji Dna wirusa. Niezwykła czułość metody okazuje się być bezcenna, gdyż można odnaleźć nawet jedna cząsteczkę odpowiadająca sekwencji wirusa w mieszaninie, i z niewielkiej ilości materiału biologicznego jak np. włos, można mieć mnóstwo użytecznych materiałów do badań.
Zastosowanie odpowiednich primerow może oswoić odkryć dowolna sekwencja, a zatem np. sekwencje DNA wirusa w początkowym stadium, a ilości materiału otrzymanego po PCR może z kolei dać obraz rozległości zmian chorobowych.
1.5 Jak sobie poradzić z tą książka?
W rozdziale 1 przedstawione zostały dwie najważniejsze techniki a właściwie ich podstawy niezbędne do zrozumienia czym zajmuje się inżynieria genetyczna. Część II opisuje jak geny i genomy są badane, a cześć III pokazuje zastosowanie technik inżynierii genetycznej w różnych dziedzinach nauki, jak np. biotechnologia.
Rozdział 2 będzie poświęcony jednej z najważniejszych jednostek badawczych – wektorom – które przenoszą materiał genetyczny do komórki gospodarza w której zostaje on powielony. Żeby zaszedł akt klonowania, cząstka musi być zdolna do wniknięcia do komórki, i do zreplikowana się w dużej ilości kopii w komórce gospodarza. Dwie podstawowe organizacje DNA odpowiadają tym zadaniom:
-plazmidy, które są małymi kolkami DNA znajdowanymi w bakteriach
-chromosomy wirusowe, a dokładnej chromosomy bakteriofagów, które infekując bakterie, przenoszą materiał genetyczny który chcemy sklonować do komórek tych małych ...
BiotechnologPWr