Mechanizmy oporności na antybiotyki.doc

T: Wykrywanie mechanizmów oporności na antybiotyki.

Oporność:

• Wrodzona (naturalna)- stała cecha gatunku, rodzaju lub rodziny;
  *geny kodowane chromosomalnie
  *transfer pionowy- przekazywanie komórkom w trakcie podziału (w obrębie gatunku)
• Nabyta- nowa cecha szczepu powstała na skutek mutacji lub nabycia genów oporności od innych bakterii
  * plazmidy, transpozony, integrony
  *transfer horyzontalny

Oporność bakterii na leki p/bakteryjne:

ü      Modyfikacja receptora dla danego antybiotyku

ü      Zmniejszenie przepuszczalności przez osłony zewnętrzne komórki bakteryjnej

ü      Czynne usuwanie leku p/bakteryjnego z komórki

ü      Modyfikacja enzymatyczna leku p/bakteryjnego- inaktywacja
!!! Ważna tu jest grupa β- laktamaz.
!!! Enzymy modyfikujące amino glikozydy.

ü      Zastępcze szlaki metaboliczne.

Metody detekcji fenotypów oporności u bakterii:

o        Metoda dyfuzyjno- krążkowa

o        Metoda oznaczenia MIC à E-testy

o        Metody automatyczne

o        inne, np. testy lateksowe (MRSA)

Fenotypy oporności bakterii:

MRSA (MRCNS)- metycylinooporny Staphylococcus aureus (metycylinooporne gronkowce koagulazo +)

MLSB

ESBL- β-laktamaza o rozszerzonym spektrum substratowym

MBL- metalo-β-laktamaza

HLAR- oporność wysokiego stopnia na aminoglikozydy

Metycylinooporność- MRSA (MRCNS):

Ø      Staphylococcus spp.

Ø      Wytwarzanie nowego białka PBP2a

Ø      Brak powinowactwa do β-laktamów

Ø      PBP- białka, są w komórce bakteryjnej, receptory dla β-laktamów, służy do syntezy ściany komórkowej, β-laktamy hamują syntezę ściany komórkowej

Ø      Wykrywanie:
* zastosowanie krążka z cefoksytyną
* oznaczenie MIC dla oksacyliny
* wykrywanie białka PBP2a
* metoda przeglądowa z oksacyliną w podłożu
*metody biologii molekularnej PCR („złoty standard”)

Ø      !!! Metycylinooporność- antybiogram odczytujemy po 24 godz.

Ø      Nie stosujemy β-laktamów

MLSB: oporność na makrolidy, linkozamidy, streptograminy B.

v      Staphylococcus spp., Streptococcus spp.

v      Modyfikacja podjednostki 50S rybosomalnej- geny erm

v      2 typy fenotypów:
> konstytutywny- niezależny od obecności antybiotyków, jest na stałym poziomie
> indukcyjny- związany z obecnością antybiotyków w otoczeniu komórki bakteryjnej
!!! Oba fenotypy są związane z poziomem ekspresji genów.

v      Wykrywanie:
* krążek z erytromycyną
* krążek z klindamycyną
!!! Ważna jest odległość między krążkami.
Przy erytromycynie w fenotypie indukcyjnym- brak strefy zahamowania wzrostu.
Przy klindamycynie- strefa wzrostu niewielka, spłaszczona z jednej strony.

Erytromycyna indukuje oporność na:
# rokitomycynę
# klindamycynę
# telitromycynę
# makrolidy
# linkozamidy
# streprograminy B

ESBL: β-laktamaza o rozszerzonym spektrum substratowym (może hydrolizować III i IV generację cefalosporyn):

• Podział β-laktamaz;
  $ wąskie spektrum substratowe
  $ szerokie spektrum substratowe (penicyliny, cefalosporyny I i II generacji)
• Pałeczki Enterobacteriaceae, pałeczki niefermentujące
• ESBL- oporność na penicyliny (bez połączeń z inhibitorami), cefalosporyny ( z wyjątkiem cefamycyny), aztreonam
• In vitro- mogą wykazywać wrażliwość na leki będące ich substratami
• Izolowane w zakażeniach szpitalnych i pozaszpitalnych
• Wykrywanie:
  * metoda DDST= test 2 krążków= DDT
  - stosujemy inhibitor β-laktamazy, kwas klawulonowy
  - inhibitor układamy na powierzchni agaru
  - na bokach układamy prążki z cefalosporynami III i IV generacji (ceftazydym, cefotaksym, cefepim)
  - krążki położone w odległości ok. 20 mm środek od środka
  - nie mierzymy stref, oceniamy ich wygląd
  ! Czasem do krążków dokładamy cefepim lub aztreonam.
  
  *test CD- test kombinacji:
  - krążki stosujemy parami
  - cefotaksym w jednym krążku, w drugim- cefotaksym+ kwas klawulonowy
  ESBL+ à rożnica średnicy stref zhamowania wzrostu ≥5-7mm
  
  * zastosowanie pasków z gradientem stężeń:
  - na jednej połówce- gradient stężenia cefalosporyny
  - na drugiej połówce- gradient stężenia cefalosporyny z inhibitorem (kwas klawulonowy)
  - liczymy indeks:
  cefalosporyna/ cefalosporyna+kwas klawulonowy ≥ 8  à ESBL +
• Nadprodukcja cefalosporynazy blokuje na oporność typu ESBL
  cefalosporynaza chromosomalna à AMPc
  By wykryć- stosujemy cefepim, bo jest oporny na AMPc à umożliwia wykrycie ESBL.
  ! Zastosowanie podłoża Müller-Hiltona z kloksacyliną ( wyłącza ona AMPc).
  Podobnie jest z testem CD.

MBLà metalo- β- laktamazy:

Ø      w centrum aktywnym mają Zn2+

Ø      Pseudomonas, Acinetobacter, Enterobacteriaceae

Ø      !!! szczeou MBL+ à oporne lub ze zmniejszoną wrażliwościa na penicyliny, cefalosporyny, karbapenemy, połączenia z inhibitorami β-laktamaz

Ø      Interpretacja- niewrażliwe na karbapenemy i inne β-laktamy z wyjątkiem aztreonamu

Ø      Wykrywanie:
* podobnie do ESBL
* rózniceà inhibitory, antybiotyki
* inhibitorà EDTA
MBL nie są hamowane przez kwas klawulonowy, sulbaktam.

Test CDà antybiotyk (imipenem, mero penem)+ EDTA
Indeks ≥ 8 à MBL+

Fenotyp AMPc:

ü      Hydrolizują antybiotyki β- laktamowe oprócz karbapenemów i cefepimu

ü      Nie są hamowane przez inhibitory (kwas klawulonowy, sulbaktam, tazobaktam)

ü      Współwystępowanie z ESBL i AMPc

ü      Mogą być wytwarzane przez niektóre rodzaje bakterii:
S- Serratia
P- Providencia
A- Aeromonas

ü      Wykrywanie:
* fenotyp indukcyjny- spłaszczone strefy zahamowania wzrostu
! test cefinazowy- służy do wykrywania aktywności β-laktamaz, wykorzystujemy tu nitrocefinę, fioletowe zabarwienie- szczep wytwarza β-laktamazę.

KPC:

§         Oporność:
CEFALOSPORYNY
PENICYLINY
CEFAMYCYNY
MONOBAKTAMY
KARBAPENEMY
PENICYLINY/ INHIBITORY β-LAKTAMAZ

§         Często:
aminoglikozydy
fluorochinolony

§         Warunkuje oporność na wszystkie β-laktamy

§         Enzym KPC hydrolizuje β-laktamy

§         Szczepy wielooporne

§         W warunkach In vitro szczepy te mogą być wrażliwe na karbapenemy

§         Kiedy podejrzewamy wytwarzanie KPC enzymów?
Enterobacteriaceae:
# oporność na cefalosporyny o szerokim spektrum
# zmienna wrażliwość na cefamycyny
# MIC ≥ 2µg/ml

§         Jak wykryć enzymy KPC?
- test wrażliwości (ASTs)
à MIC
karbapenemy MIC ≥ 2µg/ml
à metoda dyfuzyjno-krążkowa
karbapenem I lub R

§         Wykrywanie
& test KPC
- zastosowanie kwasu boranowego na krążek z meropenemem lub ertapenemem
- test Hodge’a

HLAR: oporność wysokiego stopnia na aminoglikozydy:

v      U Enterococcus

v      Mechanizm nabyty

v      Nie ma synergizmu aminoglikozydów z β-laktamami

v      Wynika z zaburzeń przepuszczalności

v      Wykrywanie:
- krążki bibułowe z antybiotykami aminoglikozydowymi
gentamycyna (120 µg)
streptomycyna (300 µg)
- metoda przeglądowa z antybiotykiem w podłożu
gentamycyna ( stężenie 500 µg/ml)
streptomycyna (2000 µg/ml)

Podłoża chromogenie- można dzięki nim identyfikować konkretne drobnoustroje, można też wykrywać mechanizmy oporności. Jest w nich substrat wykorzystywany przez bakterie.

Wielooporność:

§         Wynik działania różnych, niezależnych mechanizmów oporności

§         Np. Pseudomonas aeruginosa

§         Metycylinooporność- mechanizm oporności, z którym często współistnieje oporność na inne antybiotyki (nabyta oporność)

§         Oporność krzyżowa- oporność na antybiotyki z tej samej grupy

§         Oporność równoległa- oporność na leki o podobnym mechanizmie działania.
 

4