Podstawy Biotechnologii
Ćwiczenie 3
Na podstawie opracowania Piotra Szwedy
WYZNACZANIE ZMIAN STOPNIA HYDROLIZY BIAŁEK PODCZAS REAKCJI KATALIZOWANEJ ALKALAZĄ
Zagadnienia kolokwialne
1. Zalety i wady technologii enzymatycznych.
2. Rodzaje preparatów enzymatycznych stosowanych w przemyśle
3. Regulacja reakcji enzymatycznych
4. Przykłady zastosowań preparatów enzymatycznych
5. Oznaczanie DH metodą pH-stat
Literatura
1. Biotechnologia Żywności (red) Bednarski, W., Reps, A., WNT, Warszawa, 2001.
2. Biochemia, ćwiczenia laboratoryjne. (red) Milewski, S., Wydawnictwo PG, Gdańsk, 2000.
3. Chemia Żywności (red) Sikorski, Z.E., wyd. 5, WNT, Warszawa, 2007.
4. Enzymatyczna Modyfikacja Składników Żywności (red) Kołakowski, E., Bednarski, W., Bielecki, S., WAR, Szczecin, 2005.
Wprowadzenie
Do katalizowania hydrolizy białek często używa się alkalazę, której substancją aktywną jest subtylizyna A (endopeptydaza serynowa), wytwarzana przez bakterie Bacillus licheniformis. Enzym ten hydrolizuje wiązania peptydowe wewnątrz cząsteczki białka i nie przejawia aktywności względem wiązań na N- i C-końcu łańcucha peptydowego. Alkalaza jest enzymem o małej specyficzności, rozszczepiającym wiązania peptydowe pomiędzy resztami różnych aminokwasów. Preparat ten wykazuje największą aktywność w temperaturze 55-60 °C przy pH 8,5. Oporność cieplna wymienionego enzymu maleje w kwaśnym środowisku i przy pH < 4 ulega on inaktywacji już po 30 min ogrzewania w 50 °C, natomiast przy pH < 3 utrata aktywności następuje nawet bez ogrzewania.
W przypadku alkalazy szybką kontrolę stopnia hydrolizy można przeprowadzić rejestrując zmiany kwasowości wywołane rozszczepieniem wiązań peptydowych. Po ich rozpadzie zachodzi wymiana protonu:
- CHR-COOH + H2N-CHR « CHR-COO- + +H3N-CHR
Stopień hydrolizy oblicza się za pomocą wzoru Olsena (1985), na podstawie ilości roztworu NaOH zużywanego do zobojętniania grup –NH3+ podczas utrzymywania stałego pH procesu.
RCH-NH3+ + OH- ® RCH-NH2 + H2O
Stosowanie tego sposobu kontroli stopnia hydrolizy nie jest możliwe w przypadku enzymów działających w kwaśnym środowisku, w którym niewiele grup aminowych ma ładunek elektryczny (mała wartość a). Celem ćwiczenia jest wyznaczenie zmian stopnia hydrolizy białek w czasie reakcji katalizowanej alkalazą.
Enzymatyczna hydroliza białek mięsa i oznaczanie DH metodą pH-stat
· Do 150 g zmielonego mięsa drobiu lub ryby (umieszczonego w zlewce o pojemności 500 ml) dodać 300 ml wody destylowanej o temp. ok 70°C.
· Wprowadzić do zlewki elektrodę pH-metru, ogrzać mieszaninę do 55 °C w łaźni wodnej i doprowadzić pH do 8,5 stosując 4 M roztwór NaOH i mieszając zawartość zlewki mieszadłem mechanicznym. Objętość roztworu NaOH zużytego do wstępnej regulacji pH należy zanotować.
· Do próbek dodać 1 ml lub 4 ml alkalazy 2.4L i natychmiast rozpocząć pomiary pH wykonywane co 5 min.
· Po każdym pomiarze należy dodać z biurety taką objętość 4 M roztworu NaOH, która spowoduje przywrócenie pierwotnej wartości pH, wynoszącej 8,5. Zanotować objętość zasady dodanej po każdym pomiarze. Podczas pomiarów należy zwrócić uwagę czy zawiesina mięsa nie zakleiła elektrody i w razie potrzeby oczyścić elektrodę.
· Zakończyć pomiary po 1godz procesu.
Opracowanie wyników:
· DH po każdym pomiarze pH obliczyć korzystając z wzoru:
DH (%) = (V × M / a × h × mp) × 100
w którym:
(V) wyrażona w ml objętość 4 M roztworu NaOH zużytego w celu przeciwdziałania zmianom pH podczas procesu, pomniejszona o objętość NaOH zużytą do wstępnej regulacji pH substratu,
(M) stężenie molowe NaOH,
(h) współczynnik zależny od ogólnej ilości wiązań peptydowych w białku, którego średnia wartość dla białek mięsa wynosi 7,6,
(mp) wyrażona w gramach masa białka w próbce, obliczona na podstawie składu podstawowego badanych próbek mięsa (średnia zawartość białka w mięsie drobiu 20%).
Stopień dysocjacji: a = 10 pH – pK / (1 + 10 pH – pK)
Wartość a w temperaturze 55 °C przy pH 8,5 wynosi 1,6232
· Sporządzić wykresy zależności DH białek od czasu prowadzenia procesu i porównać ich przebiegi przy różnym dodatku alkalazy.
1
Elesmera