MATERIAŁY POMOCNICZE I ĆWICZENIA LABORATORYJNE

Z TECHNOLOGII PREPARATÓW ENZYMATYCZNYCH POCHODZENIA MIKROBIOLOGICZNEGO

Praca zbiorowa pod redakcją

Józefa Synowieckiego

Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej

Gdańsk 2007

3. ZNACZENIE I PRZYKŁADY TECHNOLOGII ENZYMATYCZNYCH

Józef Synowiecki

3.1. Charakterystyka enzymów i ich podział

3.1.1. Budowa enzymów

Enzymy są pochodzącymi z żywych organizmów biokatalizatorami znajdującymi wiele zastosowań, między innymi w przemyśle farmaceutycznym kosmetycznym, produkcji żywności i w analityce. Przez długi czas uważano, że głównym elementem wszystkich enzymów są białka. Późniejsze badania wykazały jednak przejawianie aktywności enzymatycznej przez niektóre kwasy nukleinowe, które nazwano rybozymami. Biorą one głównie udział w przekształcaniu kwasów nukleinowych wykazując charakterystyczną dla enzymów białkowych kinetykę i specyficzność działania oraz podatność na inhibicję.  Dla aktywności katalitycznej wielu enzymów niezbędne jest współdziałanie z niebiałkowymi, małocząsteczkowymi koenzymami, którymi są zazwyczaj nukleotydy, nukleozydy oraz witaminy lub ich pochodne. Koenzymy uczestniczą między innymi w przenoszeniu grup chemicznych, aktywują enzymy zmieniając ich strukturę lub biorą udział w transporcie elektronów usuniętych z substratu pod wpływem oksydoreduktaz. Niektóre z nich o labilnej lokalizacji ulegają podczas reakcji przekształceniu do formy przekazywanej w dalszym etapie szlaku metabolicznego do cząsteczki innego biokatalizatora gdzie są regenerowane.  Koenzymy trwale związane z cząsteczką białka (określaną w tym przypadku jako apoenzym) są natomiast nazywane grupami prostetycznymi.

Zdolność katalityczna enzymu i jego specyficzność działania zależy od struktury i budowy centrum aktywnego (kieszeni katalitycznej) umiejscowionego zazwyczaj we wgłębieniu cząsteczki białka. Centrum to zawiera jedno lub kilka miejsc wiążących substrat we właściwym dla przebiegu katalizowanej reakcji usytuowaniu przestrzennym oraz miejsce katalitycznie czynne. W jego skład wchodzą reszty aminokwasów i niekiedy koenzymy lub jony metali partycypujące w rozszczepianiu lub tworzeniu nowych wiązań chemicznych. Przyłączanie substratu podczas tworzenia tzw. kompleksu aktywnego zmienia w pewnym stopniu strukturę kieszeni katalitycznej ułatwiając oddziaływanie miejsca katalitycznego na przekształcany fragment cząsteczki. Skutkiem tego są zmiany konfiguracji substratów i przemieszczenie elektronów w ich cząsteczkach obniżające energię aktywacji niezbędną do zainicjowania reakcji. Tworzenie kompleksu przejściowego odbywa się z udziałem wiązań jonowych, wodorowych lub oddziaływań hydrofobowych i przebiega zazwyczaj znacznie szybciej od etapu przemiany substratów w produkty reakcji. Biokatalizatory uwikłane w cykl reakcji enzymatycznych zawierają tzw. miejsce regulatorowe (allosteryczne) charakteryzujące się powinowactwem do końcowego produktu. Skutkiem jego przyłączenia do miejsca regulatorowego jest zmiana struktury białka powodująca ograniczenie aktywności enzymu. Niezbędne do regulacji aktywności katalitycznej zmiany konformacji biokatalizatora następują w wielu przypadkach po wytworzeniu kompleksu enzymu z małocząsteczkowymi białkami lub wskutek reakcji fosforylacji oraz defosforylacji enzymu inicjowanych kolejno specyficznymi kinazami i fosfatazami. Niektóre enzymy są syntetyzowane w postaci nieaktywnych prekursorów zwanych zymogenami lub preenzymami. Ich aktywację w miejscu fizjologicznie właściwym wywołują np. działające specyficznie proteazy, usuwające fragment łańcucha polipeptydowego blokujący dostęp do centrum aktywnego.

3.1.2. Inhibitory i ich działanie

Utratę aktywności katalitycznej powodują inhibitory lub oddziaływanie rozmaitych czynników inaktywujących, jak np. podwyższona temperatura, zmiana pH, rozpuszczalniki organiczne, sole metali ciężkich lub reduktory. W przeciwieństwie do substancji inaktywujących działanie inhibitorów jest skutkiem specyficznego: odwracalnego lub nieodwracalnego przyłączania się ich cząsteczek do centrum aktywnego lub innego fragmentu łańcucha polipeptydowego biokatalizatora. Inhibitory o nieodwracalnym oddziaływaniu wiążą się z enzymem kowalencyjnie, co praktycznie uniemożliwia ich usunięcie. Inhibicję odwracalną powodują natomiast substancje, które można dość łatwo oddzielić od cząsteczek enzymu. Ze względu na sposób działania inhibitory dzielą się na kompetycyjne i niekompetycyjne. Inhibitory kompetycyjne są podobne strukturalnie do substratu i konkurują z jego cząsteczkami o centrum aktywne enzymu.  Nie powodują więc trwałej inaktywacji preparatu bo mogą być łatwo usunięte, np. przy dużym stężeniu substratu. Inhibitory niekompetycyjne łączą się natomiast z odległymi często od centrum aktywnego obszarami cząsteczek białka, zmieniając jednak ich strukturę w stopniu uniemożliwiającym katalizowanie reakcji. Niektóre inhibitory stosuje się jako leki a inne blokujące ważne fizjologicznie enzymy są silnymi truciznami. Koszt i fizjologiczne oddziaływanie inhibitorów jest powodem ograniczonego ich stosowania w celu zatrzymywania procesów przemysłowych po uzyskaniu pożądanego stopnia konwersji substratu. Dogodniejszym rozwiązaniem jest w tym przypadku inaktywacja biokatalizatora przez podniesienie temperatury lub zmianę kwasowości środowiska reakcji.

3.1.3. Optymalne warunki działania enzymów  

Przyczynami przydatności enzymów są specyficzność działania oraz duża wydajność reakcji katalizowanych w „łagodnych” warunkach. Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od wielu czynników a szczególnie od pH i temperatury procesu oraz stężenia substratu. Uzyskanie dużej aktywności preparatu enzymatycznego jest możliwe w ograniczonym zakresie pH, zapewniającym występowanie i najlepsze dla przebiegu reakcji rozmieszczenie ładunku elektrycznego w centrum aktywnym i pozostałej części białka (Rys.1).

Wynika to z faktu, że stabilność białka i przekształcenie kompleksu enzym/substrat w rozpadający się następnie kompleks enzym/produkt zależy często od oddziaływań w cząsteczce biokatalizatora. Ponadto, w niektórych reakcjach jony wodorowe lub hydroksylowe uczestniczą w reakcji a ich dostępność zależy od pH środowiska. Na szybkość reakcji wpływają też zależne od wartości pH oddziaływania elektrostatyczne białka enzymatycznego z substratem, występujące w przypadku gdy zawiera on grupy chemiczne uzyskujące charakter jonów. Optymalne pH działania enzymu często zależy od rodzaju stosowanego buforu oraz od kierunku przebiegu reakcji.

Wzrost temperatury zwiększa początkowo szybkość katalizowanej reakcji. Jednak po osiągnięciu pewnej maksymalnej wartości zależnej od rodzaju enzymu i jego pochodzenia następuje dość szybki i najczęściej nieodwracalny spadek aktywności preparatu spowodowany denaturacją białka enzymatycznego. Przyczyną niejednakowej oporności cieplnej enzymów jest zróżnicowanie energii niezbędnej do pokonania większej lub mniejszej liczby oddziaływań stabilizujących strukturę natywnego białka. Termolabilność enzymu maleje w przypadku obecności substratu, który wiążąc się z cząsteczkami białka stabilizuje drugo- i trzeciorzędową strukturę łańcucha polipeptydowego. Zmiany temperatury wpływają także na szybkość rozpadu kompleksu przejściowego, stopień zdysocjowania substratów i związków pośrednich oraz na istotne dla przebiegu reakcji oddziaływania białka enzymatycznego z jonami metali, aktywatorami i koenzymami. Ważnym czynnikiem wpływającym na wydajność reakcji jest proporcja pomiędzy ilością cząsteczek substratu i enzymu. Skutkiem zbyt małego stężenia substratu jest ograniczenie częstotliwości zderzeń jego cząsteczek z enzymem oraz niewykorzystanie wielu cząsteczek biokatalizatora. Szybkość reakcji enzymatycznej zwiększa się więc wraz ze wzrostem stężenia substratu aż do osiągnięcia wartości zapewniającej uwikłanie wszystkich cząsteczek enzymu w tworzenie kompleksu aktywnego. Miarą aktywności katalitycznej enzymu w tych warunkach jest tzw. liczba obrotów, określająca liczbę cząsteczek substratu przekształconych w jednostce czasu. Powinowactwo enzymu do substratu charakteryzuje stała Michaelisa (Km) równa liczbowo stężeniu substratu przy którym szybkość katalizowanej reakcji jest równa połowie szybkości maksymalnej (Vmax) uzyskiwanej przy pełnym wysyceniu cząsteczek biokatalizatora. Wartości Km dla większości enzymów mieszczą się w przedziale od 10-1 do 10-7 M i zależą od rodzaju substratu, temperatury i siły jonowej środowiska. Duża wartość tej stałej świadczy o niewielkim powinowactwie enzymu do substratu a w konsekwencji o małej zdolności katalitycznej enzymu.

Zjawisko hamowania nadmiarem produktów reakcji utrudnia niekiedy uzyskanie dużej wydajności procesów enzymatycznych. Jest ono skutkiem przesunięcia stanu równowagi odwracalnych reakcji enzymatycznych w kierunku przebiegu reakcji odwrotnych. Intensyfikację tych reakcji wykorzystuje się jednak podczas katalizowanej odpowiednimi hydrolazami syntezy plastein, oligosacharydów lub innych substancji. Inną przyczyną hamowania produktami reakcji jest zmniejszenie szybkości rozpadu kompleksu enzym/produkt lub też blokowanie koenzymów lub aktywatorów pod wpływem nadmiernego stężenia produktu.

Charakterystyczną cechą enzymów jest precyzja ich działania polegająca na zdolności przemiany tylko określonego substratu lub grupy substancji do siebie podobnych (specyficzność substratowa) oraz na katalizowaniu jednego typu reakcji (specyficzność funkcjonalna). Biokatalizatory działające na grupę podobnych do siebie substancji (np. lipidów lub cukrów) mogą różnić się specyficznością pozycyjną (regiospecyficznością) polegającą na zróżnicowaniu działania na takie same ugrupowania atomów lub wiązania chemiczne w zależności od ich lokalizacji w cząsteczce substratu. Niektóre enzymy katalizują przemianę tylko jednego z enancjomerów (stereospecyficzność) lub działają selektywnie na związki o konformacji cis- lub trans-. Dość istotną cechą wielu enzymów proteolitycznych jest zależność aktywności rozszczepiania wiązań peptydowych od rodzaju aminokwasów partycypujących w wiązaniu. Enzymy degradujące polisacharydy, białka lub inne wielkocząsteczkowe polimery działają na wiązania znajdujące się wewnątrz lub na końcu cząsteczek substratu. W pierwszym przypadku następuje szybkie zmniejszenie masy cząsteczkowej produktów już w początkowym okresie reakcji a w konsekwencji ważny w wielu procesach technologicznych spadek lepkości mieszaniny reakcyjnej.

3.1.4. Klasyfikacja enzymów

Zgodnie z obowiązującą klasyfikacją międzynarodową każdy enzym jest charakteryzowany czteroliczbowym numerem EC (enzyme code). Pierwsza liczba tego kodu oznacza klasę enzymu określoną na podstawie rodzaju katalizowanej reakcji (Tabela 1) a dwie następne przynależność do podklasy i grupy biokatalizatorów. Ostatnia liczba numeru EC odnosi się już do umiejscowienia konkretnego enzymu w grupie.

Tabela 1. Przykłady działania enzymów należących do różnych klas

3.2. Warunki i przykłady oznaczania aktywności enzymów

Aktywność katalityczną enzymu określa się mierząc szybkość tworzenia produktów lub ubytku substratów reakcji katalizowanej przez określoną ilość preparatu. Szybkość tych reakcji zależy jednak od wielu czynników i dlatego pomiary aktywności powinny być  przeprowadzane w ściśle określonych warunkach, obejmujących czas, temperaturę i pH reakcji oraz rodzaj i stężenie stosowanego buforu. Niezbędne jest także zapewnienie maksymalnej szybkości reakcji, uzyskiwanej w początkowym okresie jej przebiegu przy stężeniu substratów wystarczającym do wysycenia wszystkich cząsteczek biokatalizatora. Oznaczenia aktywności służą między innymi do porównania przydatności analogicznych enzymów z różnych źródeł, opracowania procedur izolowania nie powodujących pogorszenia właściwości katalitycznych enzymów, kontroli stopnia oczyszczenia preparatu oraz badania jego trwałości podczas przechowywania. Pomiary aktywności są także jednym ze sposobów sprawdzania deklarowanej przez producenta zawartości substancji czynnej (enzymu) w preparatach wytwarzanych dla potrzeb przemysłu, których zupełne oczyszczenie jest zbyt skomplikowane i kosztowne.

Obecnie powszechnie stosuje się standardową jednostkę aktywności (U) określoną przez Komisję Enzymatyczną Międzynarodowej Unii Biochemicznej. Jednostka ta odpowiada ilości enzymu katalizującej przemianę 1 mmola substratu w ciągu jednej minuty w optymalnych warunkach działania enzymu. W przypadku białek, polisacharydów i innych wielkocząsteczkowych substratów aktywność enzymu określa się na podstawie ilości mmoli grup chemicznych uwolnionych podczas stopniowej degradacji cząsteczek polimeru. Dopuszczalne jest także stosowanie jednostek pochodnych poprzedzonych odpowiednimi przedrostkami systemu metrycznego, np. mU = 10-3 U.

Inną rzadziej używaną jednostką jest katal odpowiadający ilości enzymu katalizującej przekształcenie 1 mmola substancji lub uwolnienie 1 mmola odpowiednich grup chemicznych w ciągu jednej sekundy. Do wyrażania aktywności enzymów proteolitycznych służą niekiedy jednostki Ansona określające ilość enzymu wytwarzającą w ciągu 1 min ze 100 mg hemoglobiny produkty hydrolizy nie ulegające strąceniu kwasem trichlorooctowym, które po reakcji z odczynnikiem Folina Ciocateau wywołują absorbancję równoważną 1 mmolowi tyrozyny.

Wielkością użyteczną do porównywania aktywności analogicznych enzymów pochodzących z różnych źródeł a także do określania czystości preparatu biokatalizatora jest aktywność specyficzna, czyli liczba jednostek enzymatycznych lub katali przypadająca na jeden miligram białka. Znając aktywności specyficzne: czystego białka enzymatycznego i badanego preparatu można dość dokładnie obliczyć stopień oczyszczenia preparatu oraz zawartość substancji aktywnej.

Do oznaczania aktywności enzymów przydatne są techniki analityczne zapewniające selektywne pomiary zmiany stężenia substratów lub produktów reakcji. Wykorzystuje się w tym celu kolorymetrię, spektrofotometrię, polarymetrię, chromatografię, elektroforezę, analizę miareczkową oraz pomiary fluorescencji, lepkości, zmętnienia lub efektu cieplnego reakcji. Duża różnorodność metod wykorzystywanych do oznaczania aktywności nawet tych samych biokatalizatorów utrudnia porównywanie uzyskanych wyników i dlatego normy określające sposoby kontroli procesów enzymatycznych powinny dokładnie precyzować procedurę pomiaru aktywności. Przyczyną dość częstego stosowania metod spektrofotometrycznych jest mało kosztowny i zazwyczaj nieskomplikowany sposób wykonywania oznaczeń. Duże uproszczenie pomiarów aktywności zapewnia się stosując substraty zawierające wbudowaną cząsteczkę barwnika, którego uwolnienie pod wpływem enzymu powoduje  zmianę koloru lub fluorescencję środowiska reakcji o intensywności zależnej od ilości rozłożonej substancji. Aktywność enzymów działających na wiązania zlokalizowane wewnątrz cząsteczek polimeru można określić mierząc zmiany lepkości mieszaniny reakcyjnej. W przypadku gdy podczas katalizowanego procesu są uwalniane lub pobierane protony albo zjonizowane grupy chemiczne zaawansowanie reakcji i jej szybkość oznacza się niekiedy na podstawie ilości kwasu lub zasady zużytej do utrzymania optymalnego pH reakcji. Ten sposób pomiaru aktywności jest między innymi stosowany w przypadku oksydoreduktaz i enzymów proteolitycznych działających w alkalicznym środowisku.

Krioskopowy pomiar szybkości hydrolizy zaleca producent preparatu b-galaktozydazy o nazwie Maxilact służącego do wytwarzania pozbawionego laktozy mleka lub serwatki. Oznaczenie polega na pomiarze zmiany temperatury zamarzania tych produktów wywołanego rozkładem laktozy. Obniżenie temperatury krzepnięcia jest niewielkie i nawet w przypadku całkowitej hydrolizy laktozy nie przekracza 0,27 °C. Niezbędne są więc precyzyjne pomiary temperatury oraz uwzględnienie wpływu substancji mineralnych znajdujących się w mleku i serwatce.

8