2-Hydroliza-białek-materiały.doc

MATERIAŁY POMOCNICZE I ĆWICZENIA LABORATORYJNE

Z TECHNOLOGII PREPARATÓW ENZYMATYCZNYCH POCHODZENIA MIKROBIOLOGICZNEGO

Praca zbiorowa pod redakcją

Józefa Synowieckiego

Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej

Gdańsk 2007

3.3. Źródła i kryteria wyboru enzymów

3.3.1. Źródła enzymów

Reakcje katalizowane enzymami są od dawna wykorzystywane w serowarstwie, piekarstwie, piwowarstwie, soleniu ryb, dojrzewaniu mięsa i wytwarzaniu produktów fermentacji. Przebiegają one pod wpływem enzymów pochodzących z drobnoustrojów lub znajdujących się w przetwarzanym surowcu. Pierwszymi preparatami enzymatycznymi były podpuszczka uzyskiwana z trawieńców młodych cieląt oraz słód wytwarzany z kiełkujących ziaren zbóż. W dalszym etapie rozwoju technologii enzymatycznych wykorzystano ekstrakty tkanek roślin lub organów zwierząt.  Preparaty te wykazywały niewielką aktywność katalityczną a ich zanieczyszczenie innymi enzymami prowadziło do wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych. Rozwój chromatograficznych metod oczyszczania enzymów pozwolił na wyeliminowanie tych niedogodności ale ze względu na małą zazwyczaj zawartość enzymu w tkankach konieczny jest przerób dużej ilości nie zawsze łatwo dostępnego lub trudnego do zgromadzenia surowca. Jest to jedną z przyczyn dużego rozpowszechnienia biotechnologicznych metod produkcji enzymów polegających na wykorzystaniu odpowiednio wyselekcjonowanych drobnoustrojów. Niektóre enzymy roślinne i zwierzęce są jednak nadal wykorzystywane. Ich przykładem są enzymy proteolityczne uzyskiwane z ananasa lub niektórych innych roślin tropikalnych (bromelaina, ficyna, papaina), z trzustki wołowej (trypsyna, chymotrypsyna, elastaza) oraz z soku żołądkowego trzody chlewnej (pepsyna).

Drobnoustroje charakteryzują się dużą różnorodnością wytwarzanych enzymów, często niespotykanych w tkankach roślin i zwierząt, dostępnością surowca spowodowaną szybkim przyrostem biomasy oraz możliwością intensyfikacji syntezy biokatalizatora przez zmianę składu pożywki, optymalizację warunków hodowli lub ulepszenie szczepu. Ważną zaletą jest znaczne niekiedy zróżnicowanie optymalnych warunków działania analogicznych enzymów pochodzących z różnych mikroorganizmów, co stwarza możliwość wyboru biokatalizatora dostosowanego do warunków projektowanego procesu.

3.3.2. Ulepszanie szczepów drobnoustrojów

Do ulepszania szczepów stosuje się mutacje indukowane rozmaitymi czynnikami fizycznymi lub chemicznymi (ultrafiolet o długości fali około 260 nm, promieniowanie jonizujące kwas azotowy (III), hydroksylamina, bromouracyl, aminopuryna, akrydyny lub związki alkilujące), których działanie prowadzi do przypadkowych zmian cech mikroorganizmów. Podczas przeprowadzanej w dalszym etapie selekcji wyodrębniane są mutanty charakteryzujące się:

·         dużą produkcyjnością;

·         konstytutywnym, nie wymagającym stosowania induktorów wytwarzaniem enzymu;

·         ograniczeniem syntezy innych niepożądanych enzymów lub trudnych do usunięcia metabolitów lub toksyn;

·         małą wrażliwością na działanie represorów hamujących wytwarzanie pożądanego białka;

·         wydzielaniem produkowanego enzymu do cieczy pohodowlanej;

·         odpornością na niektóre antybiotyki zapobiegające zainfekowaniu hodowli niepożądanymi drobnoustrojami;

·         korzystnymi właściwościami technologicznymi (mała zdolność pienienia hodowli, ułatwiona flokulacja komórek, ograniczone wytwarzanie śluzu);

·         małymi wymaganiami pokarmowymi, umożliwiającymi hodowlę na nieskomplikowanych pożywkach.

Oczekiwanie na pojawienie się pożądanej mutacji jest często długotrwałe i lepsze efekty daje mutageneza ukierunkowana. Polega ona na wprowadzeniu do komórek za pośrednictwem odpowiedniego wektora (plazmidu lub faga) materiału genetycznego zmodyfikowanego w zaplanowany sposób lub pochodzącego z innego mikroorganizmu. Uzyskane w ten sposób rekombinowane drobnoustroje wytwarzają zmodyfikowane lub nowe dla komórki białka i są w związku z tym przydatne do ekspresji enzymów pochodzących z ekstremofili. Ekstremofile zasiedlające biotopy niedostępne dla rozwoju innych mikroorganizmów, np. z powodu zbyt wysokiej lub niskiej temperatury, znacznego zasolenia lub nieodpowiedniego pH środowiska wytwarzają enzymy działające w warunkach powodujących inaktywację biokatalizatorów innego pochodzenia. Przemysłowe wytwarzanie enzymów z tych drobnoustrojów jest jednak utrudnione niewielką wydajnością biomasy i koniecznością prowadzenia hodowli zazwyczaj w beztlenowych warunkach, specyficznymi wymaganiami pokarmowymi oraz częstym wydzielaniem toksycznych lub działających korozyjnie metabolitów (np. H2S lub H2SO4). Rozwiązaniem problemu jest klonowanie genu kodującego syntezę ekstremofilnego enzymu do mikroorganizmu charakteryzującego się dużą wydajnością biomasy oraz możliwością hodowli w „łagodnych” warunkach, na nieskomplikowanych podłożach. Ważną zaletą rekombinowanych drobnoustrojów jest znaczna niekiedy nadekspresja enzymu, nawet do około 25 % ogólnej ilości białek komórkowych, jak też uproszczenie procedury oczyszczania biokatalizatora. Można to osiągnąć uzupełniając klonowany gen sekwencją nukleotydów kodującą syntezę wbudowywanych w cząsteczkę enzymu białkowych domen fuzyjnych o specyficznym powinowactwie do złoży chromatograficznych z immobilizowanym ligandem. Wprowadzanie domen fuzyjnych nie jest potrzebne w przypadku oczyszczania termostabilnych enzymów, które nie ulegają denaturacji w warunkach powodujących cieplne strącenie innych białek komórkowych, usuwanych następnie przez odwirowanie lub filtrację.

              Enzymy wytwarzane dla przemysłu spożywczego, kosmetycznego lub farmaceutycznego pochodzą ze stosunkowo niewielkiej liczby szczepów bakterii, grzybów lub drożdży, których przykłady zamieszczono w tabeli 2. Jedną z przyczyn tych ograniczeń jest konieczność stosowania drobnoustrojów zaklasyfikowanych jako RAS (recognized as safe). Należą do nich niepatogenne, stabilne taksonomicznie mikroorganizmy, hodowane na podłożach pozbawionych toksycznych składników i substancji mutagennych dla drobnoustrojów. Uzyskanie statusu RAS jest konieczne w przypadku produkcji każdego nowego enzymu (a szczególnie rekombinowanego) nawet w przypadku gdy pochodzi on z mikroorganizmu ocenionego jako bezpieczny. Dokonując wyboru źródła enzymu należy ponad to uwzględnić produkcyjność szczepu, warunki jego hodowli i skład pożywki oraz szybkość przyrostu biomasy komórek. Dla zachowania pełnej produkcyjności wybranego mikroorganizmu przez dłuższy czas należy prowadzić hodowlę w warunkach zapobiegających degeneracji szczepu lub zahamowania jego rozwoju z powodu zainfekowania pożywki innymi drobnoustrojami.

Tabela 2. Niektóre drobnoustroje wykorzystywane do przemysłowej produkcji enzymów

Ilość wytwarzanego enzymu jest często skorelowana z przyrostem biomasy komórek i pozostaje niezmieniona lub maleje po zakończeniu fazy wykładniczego wzrostu. W innych przypadkach synteza enzymu następuje dopiero w tzw. idiofazie kończącej etap intensywnego rozwoju hodowli. Przyczyną ograniczenia lub nawet zupełnego zahamowania produkcji niektórych biokatalizatorów może być wprowadzenie do pożywki glukozy lub innego łatwo metabolizowanego źródła węgla lub nagromadzenie się w podłożu produktów metabolizmu drobnoustrojów. Niektóre mikroorganizmy charakteryzują się zróżnicowaniem optymalnych warunków syntezy enzymu i rozwoju komórek. Przykładem tego jest Bacillus megaterium o optymalnej temperaturze rozwoju 42 °C i największej wydajności wytwarzania enzymów proteolitycznych uzyskiwanej w 28 °C. Hodowlę takich drobnoustrojów przeprowadza się dwuetapowo zmieniając temperaturę lub pH środowiska po zakończeniu okresu intensywnego przyrostu biomasy. Wydajność enzymów zewnątrzkomórkowych zależy też od szybkości ich sekrecji, którą można wielokrotnie zwiększyć dodając do pożywki czynniki permeabilizujące błonę komórkową, takie jak: niejonowe detergenty, sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS) lub niektóre sole (K+, Na+, Li+).

3.3.3. Zalety i wady technologii enzymatycznych

Technologie enzymatyczne są korzystną alternatywą wielu stosowanych już procesów chemicznych, przebiegających bez lub z udziałem rozmaitych katalizatorów. Jednym z przykładów jest przeprowadzana w kwaśnym lub alkalicznym środowisku hydroliza polisacharydów, białek i innych biopolimerów. Jedną z zalet reakcji enzymatycznych są łagodne warunki ich przebiegu ograniczające wytwarzanie niepożądanych produktów ubocznych. Duże znaczenie ma też specyficzność działania wielu enzymów umożliwiająca wytworzenie produktów o ściśle określonym składzie chemicznym i konfiguracji przestrzennej. Jest to istotne np. w przemyśle farmaceutycznym, bo rozmaite stereoizomery związku wykazują często przeciwstawne oddziaływanie fizjologiczne (lecznicze i obojętne lub nawet szkodliwe). Przy wytwarzaniu żywności kwestionowane jest niekiedy stosowanie niektórych katalizatorów ze względu na możliwość zanieczyszczenia wyrobu ich pozostałością. Zagrożenie to nie istnieje w przypadku użycia enzymów, które podobnie jak i inne białka są naturalnym składnikiem produktów spożywczych. Enzymy charakteryzują się ponad to dużą aktywnością i szybkość reakcji enzymatycznych jest zazwyczaj znacznie większa niż w przypadku stosowania innych katalizatorów. Przykładem tego jest katalaza, której jedna cząsteczka rozkłada w ciągu sekundy około 80 tys. cząsteczek nadtlenku wodoru. Nie bez znaczenia jest też fakt, że technologie enzymatyczne nie wymagają używania agresywnych chemicznie substancji i są w związku z tym bardziej bezpieczne i przyjazne dla środowiska. Wadą technologii enzymatycznych jest możliwość inaktywacji biokatalizatora pod wpływem niektórych składników przetwarzanego surowca oraz występujące w przypadku długotrwałych reakcji zanieczyszczenie reaktora mikroorganizmami dobrze rozwijającymi się w łagodnych warunkach procesu. Stosowanie dość kosztownych często enzymów nie jest celowe w przypadku gdy tradycyjna technologia jest bezpieczna dla środowiska i zapewnia wytwarzanie produktu o dobrej jakości. Planując wykorzystanie i dokonując wyboru odpowiedniego enzymu należy więc określić:

·         Jakie są pożądane zmiany właściwości przetwarzanego surowca (smak, zapach, barwa tekstura, wodochłonność, zdolność emulgowania i żelowania, zawartość składników o niepożądanym oddziaływaniu).

·         Składnik surowca, który zamierzamy zmodyfikować.

·         Możliwość uzyskania zamierzonego efektu bez udziału kosztownego enzymu.

·         Rodzaj enzymu najlepszy do wytworzenia produktu o zaplanowanych właściwościach.

·         Możliwość stosowania tańszych, mniej oczyszczonych preparatów enzymu.

·         Podatność innych składników produktu na niepożądane zmiany pod wpływem zastosowanego enzymu.

·         Czy zanieczyszczenia, a szczególnie inne enzymy znajdujące się w preparatach produkowanych dla  potrzeb przemysłu nie spowodują pogorszenia jakości produktu.

·         Sposób prowadzenia procesu (okresowy lub ciągły z zastosowaniem immobilizowanych enzymów).

·         Sposób prowadzenia reakcji (w roztworze lub na granicy faz).

·         Czy warunki procesu zapewniają stosowanie enzymu bez jego szybkiej inaktywacji.

·         Jak inne, nie przetwarzane składniki surowca wpływają na aktywność enzymu.

·         Jaka powinna być selektywność enzymu i warunki jego działania.

·         Kwasowość przetwarzanego surowca i możliwość jej dostosowania do optymalnego pH reakcji enzymatycznej.

·         Potrzebę i sposób inaktywacji enzymu w gotowym produkcie po zakończeniu procesu.

·         Czy wybrany sposób inaktywacji i pozostałość enzymu nie spowodują pogorszenia jakości produktu.

·         Jak ograniczyć hamowanie enzymu produktami reakcji.

3.4. Preparaty enzymatyczne stosowane w przemyśle i analityce

3.4.1. Rodzaje preparatów enzymatycznych

Wytwarzane dla przemysłu biokatalizatory są dostępne w formie substancji stałej lub roztworów o różnym stopniu zagęszczenia i oczyszczenia. Trzecim rodzajem preparatów stosowanych w niektórych procesach produkcyjnych są immobilizowane enzymy, których zalety i wady przedstawiono w rozdziale 6. Surowcem stosowanym do produkcji preparatów enzymatycznych jest ciecz pohodowlana z nagromadzonymi enzymami zewnątrzkomórkowymi albo ekstrakt biomasy wykorzystywany do wytwarzania enzymów wewnątrzkomórkowych. Ciekłe preparaty są zazwyczaj mało oczyszczone i oprócz substancji aktywnej (enzymu) zawierają także inne składniki. Stosuje się je do katalizowania procesów w których oddziaływanie zanieczyszczających preparat enzymów oraz pozostałych niezupełnie usuniętych składników surowca i dodanych substancji stabilizujących nie ma istotnego znaczenia. Poszczególne preparaty tego rodzaju różnią się dość znacznie aktywnością i kosztem, zależnym między innymi od stopnia oczyszczenia. Preparaty w formie stałej są produkowane przez suszenie rozpyłowe lub liofilizację oczyszczonej cieczy pohodowlanej lub ekstraktu biomasy komórek. Stosuje się także precypitację białek rozpuszczalnikami organicznymi lub przez wysalanie. Do oczyszczonego w pożądanym stopniu białka enzymatycznego dodaje się zazwyczaj rozmaite wypełniacze (skrobia, dekstryny, siarczan amonu, bentonit) pełniące jednocześnie funkcję stabilizatora zwiększającego trwałość preparatu. Produkowane dla przemysłu preparaty nigdy nie są homogennym białkiem enzymatycznym, bo tak znaczne oczyszczenie wielokrotnie zwiększa ich koszt. Usuwane są więc tylko te składniki, które przeszkadzają w przebiegu katalizowanego procesu lub inicjują wytwarzanie niepożądanych produktów ubocznych. Stosowanie znacznie oczyszczonych preparatów jest natomiast konieczne w analityce.

3.4.2. Przykłady zastosowań

Najszersze zastosowanie w przemyśle mają enzymy należące do klasy hydrolaz wykorzystywane między innymi do wytwarzania artykułów żywnościowych, utylizacji produktów ubocznych oraz w przemyśle celulozowo-papierniczym, tekstylnym, garbarstwie i produkcji środków piorących. Dość często używane są także niektóre izomerazy, oksydoreduktazy oraz transglutaminaza.

Preparaty enzymów amylolitycznych stosuje się do wytwarzania syropów skrobiowych, użytecznych jako składnik wyrobów cukierniczych i piekarskich, odżywek dla niemowląt, mleka w proszku, sosów, keczupów, zabielaczy do kawy, słodzików, dżemów oraz polioli. Wysokoscukrzone syropy służą także do otrzymywania karmelu, glukozy, syropów fruktozowych i są dodawane do brzeczki piwnej. Początkiem procesu wytwarzania syropów jest dodanie termostabilnej a-amylazy do zawiesiny ziaren skrobiowych, ogrzewanej następnie gorącą parą wodną (Rys.1). Podwyższenie temperatury do około 105 °C jest konieczne w celu degradacji i upłynnienia ziaren skrobi, co umożliwia ich enzymatyczną hydrolizę. Znacznemu wzrostowi lepkości zolu skrobiowego podczas upłynniania zapobiega szybkie rozszczepienie cząsteczek amylozy i amylopektyny na mniejsze fragmenty pod wpływem endoamylazy (a-amylazy) zachowującej aktywność w warunkach procesu. Produktami upłynniania są oligosacharydy zbudowane z 10-13 reszt glukozy oraz „dekstryny graniczne” wytwarzane z rozgałęzień cząsteczek amylopektyny zawierających nie rozszczepiane przez a-amylazy wiązania a-1,6-glikozydowe. Obecnie często stosowanym preparatem jest TermamylÒ, zawierający jako substancję aktywną a-amylazę z Bacillus licheniformis, która  zachowuje aktywność po kilku godzinach ogrzewania w 90 °C. Wytwarzane podczas upłynniania skrobi maltodekstryny są przydatne jako składnik ograniczający wysychanie wyrobów cukierniczych i zapobiegający wzrostowi kryształów lodu w mrożonej żywności oraz jako substytut lipidów w nisko kalorycznej żywności. Hydrolizat skrobiowy wytworzony z udziałem a-amylazy jest produktem pośrednim służącym do otrzymywania silnie scukrzonych syropów glukozowych oraz maltozowych. Stosuje się w tym celu glukoamylazę (EC 3.2.1.3) oraz b-amylazę (EC 3.2.1.2) odszczepiające glukozę albo maltozę od strony nieredukującego końca cząsteczek oligosacharydów. Optymalne warunki działania preparatów enzymatycznych stosowanych obecnie w etapach upłynniania i scukrzania skrobi są dość znacznie zróżnicowane. Niezbędne jest więc obniżenie pH i temperatury mieszaniny reakcyjnej przed dodaniem glukoamylazy lub b-amylazy (Rys.2). Maltogenna a-amylaza z Bacillus stearothermophilus (Novamyl) jest wykorzystywana w piekarstwie do intensyfikacji wytwarzania dekstryn ułatwiających formowanie pożądanej tekstury i zapachu skórki chleba oraz spowolnienia czerstwienia pieczywa wskutek ograniczającego retrogradację skrobi skrócenia odgałęzień cząsteczek amylopektyny.

Osiągnięcie dużej wydajności scukrzania jest między innymi utrudnione formowaniem dekstryn granicznych. Glukoamylaza działa wprawdzie na znajdujące się w nich wiązania a-1,6-glikozydowe ale szybkość reakcji jest niewielka. W przypadku b-amylazy nie wykazującej zupełnie aktywności względem wiązań a-1,6-glikozydowych tylko 50-60 % znajdującej się w skrobi amylopektyny jest przekształcane na maltozę. Ograniczenia wydajności można uniknąć stosując mieszaninę glukoamylazy lub b-amylazy z pululanazą likwidującą rozgałęzienia cząsteczek. Przyczyną zmniejszenia wydajności w przypadku stosowania glukoamylazy jest też wytwarzanie maltozy i izomaltozy jako skutek nasilenia reakcji odwrotnych po przekroczeniu 30-35 % stężenia glukozy w syropie. Hydrolizaty skrobiowe po oczyszczeniu węglem aktywnym i demineralizacji na żywicach jonowymiennych są stosowane do produkcji syropów fruktozowych używanych między innymi jako substytut sacharozy w żywności dla diabetyków. Do przekształcenia glukozy we fruktozę stosuje się immobilizowaną izomerazę ksylozową (glukozową) wykorzystując proces opisany w rozdziale 6.4.