MIKROBIOLOGIA OGÓLNA.doc

MIKROBIOLOGIA OGÓLNA – ZAGADNIENIA:

1)CECHY KOMÓRKI BAKTERYJNEJ:

Bakterie (Procaryota):

              org. jednokomórkowe;

              nie posiadają jądra, maja jeden kulisty chromosom tzw. nukleoid lub genofor;

              brak wewnętrznych ogranelli otoczonych błoną cytoplazmatyczną;

              rybosomy 70S = 30S + 50S;

              błona kom. pozbawiona steroli i cukrów (sterole to u zwierząt cholesterol i u grzybów ergosterol – są to elementy stabilizujące błonę kom.);

              rozmnażają się przez podział (replikacja i prosty podział kom.);

              ściana kom. zbudowana z peptydoglikanu;

              brak szkieletu cytoplazmatycznego;

              enzymy oddechowe znajdują się w błonie cytoplazmatycznej (znajduje się w niej łańcuch transportu elektronów, bo nie ma takich organelli jak mezozomy – mezosomy są to artefakty i nie stanowią elementów morfotycznych kom.);

              wielkość kom. bakteryjnej określamy w mikrometrach:

·         min. = 0,2 mikrometra = Chlamydia

·         max. = 250 mikrometrów = Spirocheta

              do struktur zewnętrznych kom. bakt. zaliczamy: otoczkę (jest lub nie), rzęski, fimbrie, pile.

              bakterie mają następnie: ścianę kom. (do 100 nanometrów) oraz błonę kom. (in. Cytoplazmatyczną o grubości ok. 10 nanometrów);

              do struktur wewnątrzkomórkowych bakterii zaliczamy: nukleoid, cytoplazma, rybosomy, plazmnidy, endospory.

2)WARSTWY ZEWNĘTRZNE KOMÓRKI BAKTERYJNEJ:

Struktury powierzchniowe bakterii:

1)     glikokaliks: wytworzony przez błonę cytoplazmatyczna, zbudowany jest z: polisacharydów, białek, aminokwasów i polialkoholi;

2)     śluz powierzchniowy: jest luźno związany z komórką, wykrywamy go metodami serologicznymi, są to substancje wydzielane do środowiska, można je oddzielić od powierzchni komórki przez wytrząsanie np. Leuconoscoc mesenteroides wytwarza śluz złożony z dekstranów, dekstran jest wykorzystywany w medycynie zamiast plazmy krwi i jest podstawowym składnikiem żeli dekstranowych – sefadeksów; należy pamiętać że warstwa śluzowa może być związana z komórką lub wydzielana do środowiaska np. Streptococcus salivalis – bakteria próchnicy wydziela enzym – heksyzylotransferazę, która przekształca sacharozę w polifruktozę – lewan, polisacharyd ten przyczepia się do powierzchni zębów i na nim gromadzą się kwaśne produkty fermentacji (gł. kw. mlekowy) przeprowadzanej przez streptokoki.

3)     warstwa S – cząsteczki białka pokrywające jednolicie komórkę, np. białko M u S. pyogenes, białko to występuje w postaci sześciokątów lub kwadratów;

4)     biofilm – warstwa bakterii połączona śluzem polisacharydowym, tzw. błona biologiczna homo- lub heterogenna, powoduje mniejszą wrażliwość na antybiotyki i środki dezynfekcyjne;

5)     otoczka właściwa:

              gruba warstwa nawet do 10 mikrometrów;

              wyst. U G+ i G-;

              stanowi cechę genotypową (szczepy K+ otoczkowe i mutanty bezotoczkowe K);

              środowisko ma wpływ na jej wytwarzanie;

              jej skład jest charakterystyczny gatunkowo;

              rodzaje: peptydowe (np.bakt. z rodziny Bacillus anthracis–kw. D-glutaminowy); wielocukrowe (np. polimery glukozy, ramnozy u Streptococcus i maczugowców); złożone (czyli wielocukrowo-peptydowe), np. z kw. hialuronowy – Streptococcus pneumonie lub E.coli z kw. sjalowego;

              skład chemiczny otoczek to: aminokwasy (np. glukozamina), wielocukry (homo- i heteroplimery tj.kw. glukuronowy, glukoza, ramnoza, galaktoza w zależności od typu bakterii), kw. uronowe (np. kw. glukuronowy), rzadziej zawierają: polipeptydy, białka, wielocukry i polipeptydy razem, względnie można też spotkać: kw. hialuronowy z wielocukrami;

              substancje otoczkowe łatwo są wytwarzane na podłożach bogatych w węglowodany;

              otoczka może być usunięta  bez naruszenia funkcji życiowych komórki a następnie odtworzona w odpowiednich warunkach;

              dzięli otoczkom barterie są rozpoznawane przez zwierzęta jako substancje obce;

              otoczki barwi się je negatywowo na ciemnym tle, widoczne są otoczki jasne, barwi się nigrozyną, tuszem chińskim lub czerwienia Kongo;

              otoczka może być różnej wielkości;

              na zewnątrz otoczki jest dużo wody i śluzu;

              cienka otoczka wykrywana jest metodami chemicznymi i serologicznymi, gruba natomiast za pomocą barwienia;

              funkcje otoczki:

·         chronią przed wysychaniem i oddziaływaniem związków toksycznych;

·         mogą być magazynem metabolitów;

·         chronią przed fagocytozą, ale wtedy kiedy są identyczne jak otoczki kom. gospodarza;

·         ułatwiają przyleganie do komórek gospodarza;

·         mogą się na nich znajdować miejsca, do których będą się przyłączały bakteriofagi, które są nośnikami cech innych bakterii, co ułatwia przystosowanie do środowiska;

·         bakterie otoczkowe są trudno pochłaniane i trudno trawione przez kom. żerne, dlatego są bardzo niebezpieczne dla makroustroju;

·         w otoczkach bakteryjnych zawarte są tzw. antygeny otoczkowe, posiadają inne znaczenie w klasyfikacji bakterii;

·         rezerwuar substancji odżywczych;

·         nie jest niezbędna do życia bakterii;

·         czynnik wirulencji np. u S. pneumonie;

·         ma właściwości immunogenne;

Barwienie otoczek metodą Buriego – Ginsa:

Barwienie to ma na celu uwidocznienie bezbarwnej otoczki pokrywającej z zewnątrz zabarwioną komórkę wegetatywną  na tle barwnego tła preparatu. Otoczka zbudowana jest z sub. śluzowych, zwykle polimerów cukrów i białek, może być łatwo usunięta z powierzchni komórek w wyniku podgrzewania, dlatego w tym barwieniu nie stosuje się termicznego utrwalania preparatu. Zawiesinę komórek miesza się z gruboziarnistym barwnikiem np. nigrozyną lub tuszem i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu, na tym etapie zabarwione zostaje jedynie tło preparatu, następnie kom. bakt. zabarwia się fuksyną fenolową (1-2 min.). W wyniku barwienia na ciemnym polu preparatu widoczne są nie zabarwione otoczki okalające zabarwione na czerwono komórki bakt. Jest to barwienie pozytywno- negatywne.

Ściana komórkowa:

Ogólne funkcje ściany kom:

              Ochrona protoplastu: bł. cytoplazmatycznej i cytoplazmy przed osmolizą i uszkodzeniem;

              Określa kształt bakt;

              Działa jak „sito molekularne” :większość z nich pozostawia na zew.);

              Rola w transporcie sub. odżywczych;

Ściana komórkowa bakterii Gram +:

              Elementem dominującym jest peptydoglikan – 80-90% - 40 warstw, grubość ok. 20-80 nm);

              Peptydoglikan in. mureina, muropepytd: NAG – N-acetyloglukozamina i NAM – kw. N-acetylomuraminowy tworzą poziome warstwy które połączone są ze sobą za pomocą krótkich peptydów: L-alanian, D-alanina, kw.D-glutaminowy, kw. mezodwuaminopomelinowy, L-lizyna; w ten sposób tworzy się woreczek muraminowy który otacza bakteryjny protoplast;

              U nich bardzo wyraznie widać wiązania poprzeczne i silne usieciowienie;

              Peptydoglikan nadaje kształt i stanowi mechaniczną ochronę przed środowiskiem zewnętrznym;

              Peptydoglikan ma elementy unikalne tj. NAG, NAM, kw. mezodwuamonopimelinowy, D-alanina oraz inne aminokwasy w formie D i fagocyty rozpoznają te substancje jako ciała obce;

              Unikalne właściwości peptydoglikanu zostały wykorzystane:

·         Lizozym – zawarty w śluzie, łzach, białku jaja, rozszczepia wiąznia glikozydowe w mureinie (jest N-acetylomuramidazą);

·         Penicylina – hamuje tworzenia poprzecznych wiązań peptydowych w peptydoglikanie (nie działa na G-);

·         Muroendopeptydazy – enzymy bakt., niszczą wiązania peptydowe w mureinie;

              Wyst też: kw. tejchojowy – polimer fosforanów glicerolu lub rybitolu + D-alanina, glukoza i in. jest on determinantą antygenową;

              Oraz kw. lipotejchojowy – LTA – marker infekcji, gdy kw. tejchojowy jest związany z lipidami błony cytoplazmatycznej, kwas ten działa w czasie infekcji jak lipopolisacharyd, po rozpadzie kom. bakt. dostaje się do środowiska i działa jak toksyna bakteryjna;

              kwasy te  utrzymują odpowiednią strukturę ściany kom. oraz regulują autolizę;

              białka i cukry powierzchniowe bakt. G+ związane są z peptydoglikanem, a w przypadku bakt. chorobotwórczych są silnymi antygenami, a zmiennośc ich struktury odpowiada za zmieność serotypową bakterii G+;

              W ścianie kom. zawarte są determinanty antygenowe;

              Peptydoglikan i kw. tejchojowy uruchamiają dopełniacz na drodze lektynowej i alternatywnej;

              Białka powierzchniowe na peptydoglikanie działają jako: enzymy, adhezyny, inwazyny oraz chronią przed fagocytozą i zlizowaniem przez dopełniacz;

Ściana komórkowa bakterii G-:

              Ich ściana jest cieńsza i zawiera mało peptydoglikanu;

              Składa się z: bł. zew., peptydoglikanu (5-10%, grubość ok. 10-15 nm, nie wystepują wiązania peptydowe a woreczek ma duże oczka, jedna warstwa mureiny) i przestrzeni periplazmatycznej;

              Peptygoglikan połączony jest z błoną zew. za pomocą lipoproteiny Browna (jest to cząsteczka antypatyczna – cz. hydrofilowa połączona jest z peptydoglikanem, a cz. hydrofobowa z lipidami bł. zew.);

              Lipidy tworzą charakterystyczną dwuwarstwę: cz. hydrofilowa – na zew., hydrofobowa – do środka, co zapewnia jej stabilność;

              Białka błony zew.- ok.50% zaw. warstwy, enzymy – np. białka Omp, skł. lipoproteiny Browna, f. transportowe, białka stabilizujące strukturę błony, białka pełniące rolę adhezyn, białka ochronne przed reakcjami immunologicznymi;

              Bł. zewnętrzna: zbudowana jest z LPS, dwuwarstwy lipidowej (fosfolipidy podobne do tych w bł. cyt.) oraz białek: lipoproteina Browna, enzymy, białka specyficzne transportowe (np. żelaza, maltozy, witamin), białka porynowe;

              błona zwenętrzna stanowi ochronę przed środowiskiem;

              Funkcja błony zewnętrznej: selektywna bariera dla cząsteczek zew. i wew. Gdyż jest półprzepuszczalna: przepuszcza cząsteczki hydrofilowe i jony lecz stanowi barierę dla cząsteczek hydrofobowych i amfipatycznych oraz białek, dodatkowo chroni przed lizozymem;

              Białka transportowe błony zewnętrznej tworzą kanały wyprowadzające wodę i wprowadzające na zasadzie transportu biernego różne substancje;

              Inne białka błony zewnętrznej wychwytują różne metabolity ze środowiska;

              LPS zbudowany jest z:

·         łańcuchów polisacharydów (antygen O – antygen somatyczny), rdzenia oligosacharydowego (antygen CA) i lipidu A;

·         na zew. kom. wystają łańcuchy polisacharydowe – ich skład i sekwencja cukrów jest charakterystyczna nie tylko dla gatunków ale i dla szczepu, efekt immunogenny, czynnik rozpoznania i identyfikacji bakterii, łańcuchy te są zarówno liniowe jak i rozgałęzione;

·         rdzeń oligosacharydowy – antygen swoisty grupowo, region konserwatywny, zb. z cząsteczek glukozy, galaktozy, które są połączone z fostorem, fosforan heptozy, kw. 2-keto-3-deoksyaktuzonowy (Kdo) i inne cukry; funkcją jego jest: region konserwatywny stanowiący antygen swoisty grupowo;

·         lipid A – budowa: główka: 2 cząsteczki fosforyloglukozaminy, ogonek – łańcuchy kwasów tłuszczowych, odpowiada za reakcje w makroorganizmie: objawy ogólne, efekt pirogenny, stan zapalny, leukocytozę i leukopenie, hipoglikemie, zakrzepy naczyniowe, zaburzenia snu, szok septyczny, śpiączkę i śmierć; stanowi także barierę dla cząsteczek hydrofobowych tj. sole żółciowe, detergenty, antybiotyki lipofilne; aktywuje dopełniacz drogą alternatywną, powoduje proliferację szpiku kostnego oraz pełni rolę adiuwanta (nieswoista stymulacja odpowiedzi immunologicznej); ;

·         LPS stanowi endotoksynę bakteryjną, ma właściwości immunogenne, cz. cukrowa LPS ma właściwości hydrofobowe, jest swoista antygenowo, warunkuje przepuszczalność LPS, stanowi receptor dla bakteriofagów oraz stanowi ochronę przed układem immunologicznym;

·         LPS – nadaje sztywność, działa podobnie jak peptydoglikan i kw. tejchojowy, stanowi determinantę antygenową, LPS + białka wiążące LPS (we krwi) + rec. CD14 makrofagów = aktywacja makrofagów = wydzielenie cytokin = stan zapalny = szok septyczny = śmierć.

·         Wyróżnia się formy: szorstkie – R – nie posiadaja łańcucha O – swoistego, gładkie – S -  O – antyden zawiera wiele jednostek oligosacharydowych, oraz formy półszorstkie – SR - o O – antygenie zbudowanym z 1 jednostki oligosacharydu;

              Przestrzeń periplazmatyczna:

·         Ma charakter żelu;

·         zawiera: peptydoglikan (1-2 warstwy), białak sensorowe i transportowe oraz enzymy hydrolityczne: fosfatazy – rozkład cząst. zaw. fosfor, fosfataza alkaliczna – degradacja DNA, proteazy, endonukleazy; białka wiążące odpowiadające za transport substancji odżywczych; białka unieczynniające antybiotyki beta laktamowe np. penicylinę, aminoglikozydowe np. streptomycynę; białka osmotycznej ochrony i oligosacharydy osmotycznej ochrony;

·         znajduje się pomiędzy ścianą komórkową a błoną cytoplazmatyczna

·         przepuszcza elektrony;

·         chroni przed szkodliwymi czynnikami i odgrywa rolę w transporcie substancji odżywczych;

Barwienie bakterii metodą Grama:

Barwienie w zależności od budowy ściany komórkowej

Podstawowe badanie w diagnostyce bakterii;

Fiolet krystaliczny (3 min) i płyn Lugola (jod w jodku potasu, 1,5 min) – u bakt. G+ i G- powstaje kompleks jod - pararozanilinowy, odbarwianie alkoholem (2 min) – G+ - odwodnienie peptydoglikanu, denaturacja peptydów, wytrącenie szkieletu cukrowego, trwałe uszczelnienie ściany, kompleks nie może się wypłukać, u G- natomiast jest mało peptydoglikanu, brak uszczelnienia, wyekstrahowane fosfolipidy i barwny kompleks wypłukany, bakt. bezbarwne; dobarwianie fuksyną zasadową – jest to barwnik kontrastowy, zabarwia bakt. G- na czerwono (30 s);

W zewnętrznych warstwach kom. G+ stwierdza się kompleks rybonukleinianu magnezu i zasadowego białka w ilościach istotnie wyższych niż u G-;

Z kompleksem wiąże się trwale kompleks fioletu krystalicznego z jodem – fioletowa barwa bakt. G+;

Różnice w wielkości punktu izoelektrycznego (G+ =2,3, G-= 4,5), powierzchnia bakt. G+ jest bardziej ujemna, ma silne powinowactwo do barwników zasadowych tj. fiolet krystaliczny w porównaniu do bakt. G-;

Barwliwość bakterii w tej metodzie zal. od wieku hodowli i podłoża, np. laseczki Clostridium są G+, ale w starszych hodowlach stają się G-;

Niedobór magnezu w podłożu może również być przyczyną zmiany barwliwości;

U bakt. G+ alkohol powoduje wytrącenie szkieletu cukrowego peptydoglikanu i denaturację tetra- i penta– peptydów i mostków peptydowych = trwałe zamknięcie porów pomiędzy poszczególnymi warstwami mureiny – zatrzymanie kompleksu z jodem w komórce;

U bakt. G- alkohol nie działa tak mocno aby kompleks fioletu z jodem mógł w nich pozostać, dodatkowo niszczy błonę zewnętrzną, ekstrahując z niej fosfolipidy, a tym samym ułatwia wypłukiwanie kompleksu barwnego, dlatego barwi się komórki barwnikiem kontrastowym.

Ściana komórkowa bakterii kwasoopornych i alkoholoopornych:

              Charakterystyczna dla bakt. z rodzaju Mycobacterium;

              Zb. z : glikolipidów: lipoarabinogalaktan i lipoarabinomannan; kw. mykolowy – jest to kwas o długich i rozgałęzionych łańcuchach; peptydoglikan;

              Mykobakterie to pałeczki proste lub lekko zgięte, są tu gatunki zarówno chorobotwórcze jak i saprofityczne np. Mycobacterium tuberculosis – prątek gruźlicy, Mycobacterium bovis – prątek bydlęcy i saprofityczny Mycobacterium phlei;

              Prątki mogą tez mieć prawie kulisty kształt, tworzyć skupiska i palisady;

              Prątki są: G+, nieruchliwe, nieprzetrwalnikujące, a M. tuberkulosis tworzy charakterystyczne kolonie w formie kalafiora;

              Kwaso- i alkoholooporność dzięki: zawartości dużej ilości substancji lipidowo-woskowych (40-60%) i małej ilości peptydoglikanu, związki te działają impregnująco i nadają komórkom charakter silnie hydrofobowy, komórki takie wykazują brak powinowactwa do wody, alkoholi i kwasów a także leków, substancji spowalniających ich wzrost, barwników, środków chemicznych, detergentów, humoralnych elementów odpowiedzi immunologicznej, co wiąże się z jej nieprzepuszczalnością;

              Wykryto 3 kwasy tłuszczowe odpowiedzialne za tą cechę: kwas tuberkulostearynowy, kwas ftionowy wchodzące w skład ściany komórkowej i kwas mykolowy – zawarty w cytoplazmie, w kompleksie z cukrami;

              Cecha kwasooporności może zanikać w starszych hodowlach;

              Kwas mykolowy w przypadku śmierci bakterii wydostaje się na zewnątrz, łączy się z makrofagami w płucach i powoduje ich zablokowanie – tkanka staje się bezbronna.

Barwienie bakterii kwasoopornych metodą Ziehl – Neelsena:

              Przygotowany preparat barwimy fuksyną fenolową Ziehla (3-5 min), barwienie należy prowadzić na gorąco, podgrzewając preparat 3-5 razy od spodu do pojawienia się pary;

              Temperatura rozluźnia strukturę lipidowo woskową i umożliwia wniknięcie barwnika do wnętrza komórki, na tym etapie barwią się wszystkie komórki na czerwono;

              Płukanie wodą;

              Odbarwianie: 3% roztworem HCl w 96% alkoholu etylowym;

              Po obniżeniu temp. Struktury fosfolipidowe wracają do wyjściowego stanu, alkohol i kwas solny nie wnikają  do wnętrza komórek, więc barwnik pozostaje w komórkach, u innych bakterii fuksyna ...