Zadanie2_biot.doc

Zadanie 2.

Temat: Fluorymetryczne oznaczanie zawartości witaminy C w sokach z warzyw i owoców

Wykaz materiałów

- owoc cytryny i papryki, kiszona kapusta,

- 4 zlewki o pojemności 100 ml, 4 probówki wirówkowe, tarka plastykowa, folia aluminiowa, moździerz, nylon

- lejek szklany, statyw, sączki bibułowe

- pipety automatyczne nastawne 0,5-5 cm3 i 0,1-1 cm3

- 4 kolby erlenmayera 100 cm3, 4 kolby miarowe o pojemności 100 cm3

Sprzęt: wirówka, wytrząsarka, waga elektroniczna, spektrofluorymetr

Stosowane roztwory

- Roztwór standardowy kwasu askorbinowego zawiera 4 mg odczynnika w 100 cm3 0.2M wodnego roztworu kwasu mrówkowego (przygotowujemy na świeżo).

- W celu przygotowania roztworu utleniającego rozpuścić 1,3 g I2 w 10 cm3 40% KI, dodać 0.1 cm3 7 M HCl i uzupełnić wodą do objętości 100 cm3. 0,1 M roztwór Na2S2O3 przygotować przez rozpuszczenie w 100 cm3 wody 2,5 g odczynnika i 0,02 g Na2CO3. Roztwory I2 i Na2S2O3 przechowywać w lodówce i bezpośrednio przed użyciem rozcieńczać odpowiednio (jak?) do stężenia 0,005 i 0,01 M.

- Odczynnik do derywatyzacji zawiera 10 mg o-fenylenodwuaminy w 10 cm3 5 mM H2SO4.

Wprowadzenie

Witaminy są to niskocząsteczkowe związki organiczne, o różnorodnej budowie chemicznej, rozpowszechnione w świecie roślinnym i zwierzęcym. Witaminy są katalizatorami ogólnych lub swoistych reakcji biochemicznych, wchodzą w skład enzymów i koenzymów, są niezbędne do wzrostu i podtrzymania funkcji życiowych. Dla wielu organizmów, w tym zwierząt i człowieka są to na ogół związki egzogenne i muszą być dostarczane z pożywieniem. Niektóre z nich okazały się również egzogennymi czynnikami wzrostowymi dla różnych drobnoustrojów, a dwie niezbędnymi biokatalizatorami, dostarczanymi przez bakterie glebowe roślinom wyższym (witamina B12) i niższym (witamina B1).

Niektóre witaminy wytwarzają zwierzęta z odpowiednich związków syntetyzowanych przez rośliny. Takie związki nazywane są prowitaminami np. β-karoten. Źródłem witamin i prowitamin są rośliny i bakterie żyjące w przewodzie pokarmowym, a także tkanki zwierząt. Rzeczywiste zapotrzebowanie ilościowe na poszczególne witaminy jest trudne do określenia min. ze względu na synergiczne działanie wielu z nich. Zależy ono od cech osobniczych, stanu zdrowia i okresu życia człowieka. Objawy wywołane całkowitym brakiem witamin zwane są awitaminozami. We współczesnym świecie zwłaszcza w krajach rozwiniętych awitaminozy należą do rzadkości. Często występują z kolei niedobory witamin tzn. niekorzystne stany pośrednie między awitaminozą a optymalnym zaspokojeniem zapotrzebowania organizmu na określoną witaminę, czyli hipowitaminozy. Na ogół są one spowodowane niewłaściwym, jednostronnym odżywianiem, wadliwym przyswajaniem witamin z pokarmu oraz zniszczeniem bakterii w przewodzie pokarmowym (przez antybiotyki, sulfonamidy). Niedoborom witamin zapobiega spożywanie różnorodnych pokarmów. Z kolei nadmierne przyjmowanie preparatów witaminowych, głównie witamin rozpuszczalnych w tłuszczach, może prowadzić do szkodliwych dla organizmu objawów, zwanych hiperwitaminozami.

Zawartość witamin w surowcach i produktach żywnościowych jest więc jednym z głównych wskaźników ich jakości oraz prawidłowości stosowanych zabiegów technologicznych gdyż większość witamin to substancje bardzo wrażliwe na działanie różnych czynników fizycznych i chemicznych, dlatego ich straty bywają stosunkowo duże.

Kwas L-askorbinowy (witamina C)

Przed poznaniem budowy chemicznej witamina C była nazywana czynnikiem przeciwgnilcowym. Zapobiegała bowiem szkorbutowi, który znali już Wikingowie i zwalczali za pomocą cebuli. W 1928 Szent-György uzyskał z wyciągów z nadnerczy, kapusty i pomarańczy związek, który wykazywał właściwości oksydoredukcyjne. Szent-György nie zdawał sobie sprawy, że związek ten to witamina C nazwana przez niego kwasem heksuronowym. W 1932 Wang i King otrzymali witaminę C z cytryny. W rok później Haworth, Hirst i współpracownicy ustalili budowę chemiczną witaminy C. W latach 1933-34 Reichstein i współpracownicy dokonali syntezy kwasu askorbinowego (nazwa ta pochodzi od szkorbutu). Własności witaminy wykazuje C kwasu L-askorbinowy oraz jego forma utleniona - kwas L-dehydroaskorbinowy. Pod względem chemicznym kwas L-askorbinowy jest laktonem endiolu kwasu 2-okso-L-gulonowego, a kwas L-dehydroaskorbinowy laktonem kwasu 2,3-diokso-L-gulonowego.

Budowa chemiczna kwasu askorbinowego i kwasu dehydroaskorbinowego

Kwas L-askorbinowy jest związkiem krystalicznym, dobrze rozpuszczalnym w wodzie a jego roztwory mają smak kwaśny. Wykazuje właściwości redukujące. W warunkach beztlenowych jest odporny na wysoką temperaturę. Kwas dehydroaskorbinowy jest mniej trwały w tych warunkach i tym tłumaczy się straty witaminy C podczas ogrzewania. W obecności tlenu obie formy ulegają nieodwracalnemu utlenianiu do produktów nieaktywnych biologicznie, zwłaszcza w obecności jonów niektórych metali, szczególnie Cu2+ i Fe3+. Układ oksydoredukcyjny kwas askorbinowy↔kwas dehydroaskorbinowy uczestniczy w regulowaniu potencjału oksydoredukcyjnego w komórce i bierze udział w transporcie elektronów. Ponieważ witamina C występuje w znacznych ilościach w gruczołach nadnercza, przypuszcza się, że uczestniczy ona w syntezie hormonów sterydowych. Witamina C, uczestniczy w produkcji kolagenu i podstawowych białek w całym organizmie (kości, chrząstki, ścięgna, więzadła). Jako jeden z najważniejszych przeciwutleniaczy pełni także istotną funkcję w reakcjach odtruwania i odporności organizmu chroniąc go przed procesami utleniania, uczestniczy w metabolizmie tłuszczów, cholesterolu i kwasów żółciowych. Jest czynnikiem stabilizującym układ odpornościowy i immunologiczny, hamuje powstawanie w żołądku rakotwórczych nitrozoamin. Ma właściwości bakteriostatyczne i bakteriobójcze w stosunku do niektórych drobnoustrojów chorobotwórczych. Dla większości ssaków kwas askorbinowy nie jest witaminą, gdyż mogą go samodzielnie syntezować. Jedynie człowiek, małpy człekokształtne i świnka morska nie produkują enzymu przekształcającego lakton kwasu L-gulonowego w kwas askorbinowy. Zapotrzebowanie człowieka na witaminę C jest bardzo duże, o około dwa rzędy wielkości większe niż na inne witaminy, wynosi średnio 50- 100 mg. Niedobór kwasu askorbinowego, objawiający się: wolniejszym gojeniem się ran, bladością skóry i błon śluzowych, zaburzeniami w przemianie kwasów tłuszczowych, osłabieniem naczyń włosowatych i możliwością powstawania mikrowylewów w różnych narządach, zmniejszeniem odporności na infekcje oraz występowaniem szkorbutu (obrzęki i krwawienie z dziąseł oraz wypadanie zębów), występuje dziś niezwykle rzadko. Nadmiar witaminy C jest usuwany z moczem, jednakże stosowanie wysokich dawek powoduje zakwaszenie moczu, upośledzając w ten sposób wydalanie stałych kwasów i zasad. Kwaśny odczyn moczu może powodować wytrącanie się moczanów i cytrynianów oraz tworzenie się kamieni w drogach moczowych. Do głównych źródeł witaminy C należą owoce i warzywa, ponadto z uwagi na duże zapotrzebowanie organizmu na tę witaminę oraz straty w procesach kulinarnych i technologicznych duże znaczenie ma wytwarzanie produktów wzbogaconych w witaminę C oraz witaminy syntetycznej.

Tabela. Zawartość witaminy C w wybranych warzywach i owocach

Wykonanie doświadczenia

1. Przygotowanie ekstraktów – Wycisnąć do zlewek po ok. 10 cm3 soku z cytryny, kiszonej kapusty i utartych na tarce a następnie w moździerzu ok. 40 g czerwonej papryki. Roztartą paprykę przeciskamy przez podwójną warstwę nylonu i sączymy do probówki przez sączek bibułowy. Objętość przesączu zmierzyć za pomocą cylindra. Masą i objętość przesączu papryki wpisać do arkuszu pracy. Przesączamy również dwa pozostałe ekstrakty.

2. Oznaczanie metodą fluorymetryczną

Oznaczenie polega na utlenieniu kwasu L-askorbinowego do L-dehydroaskorbinowego i przeprowadzeniu reakcji z o-fenylenodiaminą, w wyniku której powstaje fluoryzujący kompleks. Jego natężenie mierzy się przy dł. fali światła wzbudzającego λ Ex = 365 nm oraz dł. fali pomiaru światła emitowanego λ Em = 430 nm.

Próbki po 2 ml przesączów i roztworu standardowego przenieść do 4 kolb miarowych o poj. 100 cm3 i dodać po 0,3 cm3 0.005 M roztworu I2, wytrząsać przez 1 min i dodać po 0,3 cm3 0.01M Na2S2O3 (roztworu I2 i Na2S2O3 rozcieńczyć z roztworów wyjściowych).

Doprowadzić pH prób do wartości ok. 6,0 dodając po ok. 0,6 cm3 1 M NaOH i przeprowadzić derywatyzację poprzez dodanie po 0,3 cm3 roztworu OPDA i wytrząsanie przez 30 min. na wytrząsarce. Roztwór w kolbie uzupełnić do 100 cm3, wymieszać, a następnie przenieść po ok. 2 cm3 roztworu do probówek wirówkowych eppendorfa, odwirować przy maksymalnej sile odśrodkowej i za pomocą fluorymetru zmierzyć fluorescencję prób. Pomiar fluorescencji na podstawie osobnej instrukcji w obecności prowadzącego zajęcia.

Zawartość witaminy C w próbach wyliczamy na podstawie porównania ich fluorescencji i fluorescencji próby standardowej. Wyniki umieścić w Tabeli: