Borelioza 2014 Diagnostyka laboratoryjna chorob odkleszczowych.pdf

(961 KB) Pobierz

Diagnostyka laboratoryjna

chorób odkleszczowych

Rekomendacje Grupy Roboczej:

Krajowa Izba Diagnostów Laboratoryjnych

Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego-Państwowy Zakład Higieny

Konsultant Krajowy w dziedzinie chorób zakaźnych

Klinika Chorób Zakaźnych i Neuroinfekcji Uniwersytet Medyczny w Białymstoku

Polskie Towarzystwo Wirusologiczne

Warszawa 2014

Druk: GAUDIUM Lublin

dr hab. Tomasz Chmielewski,

dr Justyna Dunaj,

dr hab. Elżbieta Gołąb prof. NIZP-PZH,

2,5

dr hab. Włodzimierz Gut prof. NIZP-PZH,

dr hab. Andrzej Horban,

prof. dr hab. Sławomir Pancewicz,

1,5

dr Elżbieta Puacz,

dr Danuta Szelenbaum-Cielecka,

prof. dr hab. Stanisława Tylewska-Wierzbanowska

Kleszcze jako wektor i rezerwuar chorób infekcyjnych

tyl życia współczesnych społeczeństw post-industrialnych, aktywny wypo-

czynek, rozwój turystyki, sporty ekstremalne, chęć poznawania i zajmowania

nowych, kiedyś nieosiągalnych terenów, niosą za sobą czasami ujemne skutki

i są nowymi czynnikami zwiększonego ryzyka zakażenia się drobnoustrojami

przenoszonymi przez wektor jakim są kleszcze. Wiele z tych zakażeń występuje

sezonowo, w okresie aktywności różnych gatunków pajęczaków. W naszej stre-

fie klimatycznej, mogą one być wektorem przenoszącym zakażenia od wiosny do

jesieni.

Kleszcze są to pasożyty, o dużym znaczeniu dla medycyny ludzkiej i wete-

rynaryjnej. Są one rezerwuarem i wektorem wielu chorobotwórczych dla czło-

wieka wirusów, bakterii i pierwotniaków. W organizmie kleszcza dochodzi do

namnażania się i zmian właściwości antygenowych drobnoustrojów oraz utrzy-

mywania się w organizmie przenosiciela przez kolejne jego stadia i pokolenia.

Są one wektorem biologicznym, w odróżnieniu od innych stawonogów, mogą-

cych przenosić różne drobnoustroje z jednego osobnika na drugiego w sposób

mechaniczny i przypadkowy. Powszechnie stosowane zabiegi higieniczne w sto-

sunku do tych drobnoustrojów są mało skuteczne.

Wzrost temperatury otoczenia powoduje wzrost aktywności kleszczy, któ-

ra rozpoczyna się na przełomie marca i kwietnia i trwa do października/listo-

pada. Maksimum aktywności zależy od czynników klimatycznych i przebiega

w Europie Środkowej w dwóch fazach, tzn. w maju/czerwcu i we wrześniu/

październiku. W Polsce rozpoczyna się od połowy kwietnia (czasem wcześniej,

w marcu) i trwa do początku listopada, z dwoma szczytami – pierwszym od maja

do połowy czerwca, drugim we wrześniu.

W Polsce, największe znaczenie medyczne i weterynaryjne obok kleszcza po-

spolitego

Ixodes ricinus,

mają:

Argas reflexus

(obrzeżek gołębi) i

Dermacentor reti-

culatus

(kleszcz łąkowy). Na terenie Polski kleszcze te mogą być przenosicielami:

boreliozy z Lyme, anaplazmozy, bartonelozy, kleszczowego zapalenia mózgu,

tularemii, gorączki Q, babeszjozy, a także riketsjoz z grupy gorączek plamistych.

Diagnostyka laboratoryjna chorób odkleszczowych

Tabela 1. Najczęściej występujące choroby przenoszone przez kleszcze

Czynnik

Gatunek kleszcza

etiologiczny

Borrelia burgdorferi Ixodes sp.

sensu lato

Anaplasma

Ixodes sp.

phagocytophilum

TBEV

Ixodes sp.

Babesia sp.

Rickettsia conori

Choroba

Borelioza z Lyme

Anaplazmoza

Rejon występowania

Ameryka Północna,

Europa, Azja

Ameryka Północna,

Europa

Europa, Azja

Cały świat

Europa, Afryka, Azja

płd.

Ameryka Północna,

Środkowa i Południowa

Azja

2. Rodzaje badań diagnostycznych

2.1. Badania mikroskopowe

Osoby wykonujące badania mikroskopowe muszą posiadać ukończony 24-go-

dzinny kurs: badania mikroskopowe zabarwionych rozmazów krwi w kierun-

ku zarażeń pierwotniakami, rekomendowany przez Krajową Izbę Diagnostów

Laboratoryjnych. Złoty standard w diagnostyce zarażeń pierwotniakami stano-

wi badanie mikroskopowe zabarwionych rozmazów krwi. Rozmazy, co najmniej

dwa cienkie i dwa grube, należy wykonać

bezpośrednio po pobraniu krwi.



Krew pełna pobrana na antykoagulant (EDTA), najlepiej krew włośniczkowa

z opuszki palca pobrana do probówki z kapilarą (200-500µl), albo krew z żyły (2 ml)



Krew dostarczyć do laboratorium jak najszybciej w czasie 2 godzin od pobrania.



Jeżeli przewiduje się długi czas transportu wskazane jest zrobienie ze świe-

żej krwi dwóch cienkich i dwóch grubych rozmazów. Po ich wyschnięciu

(w temperaturze pokojowej) w odpowiednim opakowaniu do transportu

szkiełek mikroskopowych, należy dostarczyć je do laboratorium, w raz z prób-

ką krwi pobranej do probówki.



Zwłoka przy wykonaniu rozmazów może spowodować zmiany w morfologii

pasożytów i zmianę ich charakterystycznego zabarwienia.

Próbki krwi włośniczkowej

Próbki należy pobierać do kapilar z EDTA:

– u dorosłych: z 3 lub 4 palca ręki lub płatka ucha,

– u dzieci: z dużego palca u nogi lub z pięty.

Materiały pomocnicze

cienkie szkiełka podstawowe z matowym końcem, bez odprysków i zadrapań,

odtłuszczone przed użyciem,

rylec lub ołówek do naniesienia danych identyfikacyjnych na matowej części

szkiełka,

alkohol,

pipeta jednorazowa cienka lub pipeta nastawna z jednorazowymi końcówkami.

R. rickettsii

R. sibirica

Kleszczowe zapalenie

mózgu

Ixodes sp.

Babeszjoza

Rhipicephalus sanguineus

Gorączka guzkowa

Hyalomma plumbeum,

Dermacentor marginatus,

D. reticulatus.

Dermacentor variabilis,

Gorączka plamista Gór

D.andersoni

Skalistych

Dermacentor nuttallii,

D. marginatus, D.

reticulates, Hyalomma

asiaticum

Dermacentor reticulatus

Amblyomma

hebraeum

and

variegatum

Ixodes sp.

Północno-azjatycka

gorączka kleszczowa

TIBOLA/DEBONEL

Gorączka

bezwysypkowa

(Aneruptive fever)

Afrykańska gorączka

odkleszczowa

Bartoneloza

Erlichioza

Tularemia

Gorączka Q

R. slovaca

R. haelvetica

R. africae

Bartonella sp.

Europa

Afryka, Europa

(zawleczenia)

Ameryka Północna,

Europa

Ameryka Północna,

Europa, Mali

Ameryka Północna,

Europa

Cały świat

Ehrlichia chaffensis Ixodes sp.

Francisella

tularensis

Coxiella burnetii

Różne gatunki kleszczy

–

DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA

1. Informacje ogólne i wymagania prawne

1.1. Zlecenie badania laboratoryjnego

Medyczne laboratorium opracowuje, wdraża i stosuje procedurę zlecania ba-

dań laboratoryjnych oraz formularz zlecenia badania laboratoryjnego zgodnie

z rozporządzeniem Ministra Zdrowia o standardach jakości w medycznym labo-

ratorium diagnostycznym.

Dokumentacja medyczna w medycznym laboratorium, w tym zlecenia ba-

dań laboratoryjnych, jest prowadzona, przechowywana i przetwarzana zgodnie

z przepisami dotyczącymi dokumentacji medycznej.

–

Sporządzenie rozmazów

– rozmaz cienki: 3 µl (kroplę) krwi umieścić na końcu szkiełka podstawowego

a następnie rozprowadzić na 1/3 powierzchni za pomocą drugiego szkiełka

o oszlifowanych krawędziach. Szkiełko, pochylone pod katem 30-45°, prze-

ciągamy ruchem jednostajnym ku przodowi. Rozmaz powinien być jednolity

i zawierać jedną warstwę komórek.

– rozmaz gruby: (gruba kropla) 6 µl (dwie krople) krwi należy rozprowadzić

rogiem innego szkiełka, na powierzchni odpowiadającej średnicy 16-20 mm

(monety 10-20 groszowe).

Rozmazy pozostawiamy do wyschnięcia w pozycji poziomej, w temperaturze

pokojowej (21

C ± 4

C), zabezpieczone przed zanieczyszczeniem.

Diagnostyka laboratoryjna chorób odkleszczowych

Tak przygotowane rozmazy należy przesłać do laboratorium wykonującego

badania parazytologiczne.

Barwienie metodą Giemsy

– 5% roztwór Giemsy w objętości około 5 ml nanieść na preparat i pozostawić

przez 40 min.,

– spłukać delikatnie niewielką ilością wody,

– pozostawić do wyschnięcia najlepiej w pozycji skośnej.

UWAGA:

Przed barwieniem cienki rozmaz należy utrwalić metanolem i pozo-

stawić do wysuszenia. Preparatów z grubą kroplą nie należy utrwalać!

Ocena mikroskopowa zabarwionego preparatu

Ocena jest przeprowadzana po naniesieniu olejku immersyjnego, pod powięk-

szeniem obiektywu 100x. Ocena powinna obejmować 1 cm

rozmazu lub co naj-

mniej 300 pól widzenia lub co najmniej 20 000 krwinek.

Czas badania jednego

preparatu wynosi nie mniej niż 20 min.

Wynik badania

Wynik powinien zawierać opis kształtu, wielkości, liczby i ułożenia w krwin-

ce wykrytych pasożytów. W sprawozdaniu z badania powinny znaleźć się także

informacje o parazytemii (intensywność inwazji).

Intensywność inwazji

– w cienkim rozmazie określa się odsetek krwinek zarażonych przypadających

na co najmniej 500 policzonych (wg wzoru: liczba zainfekowanych RBC/całko-

wita liczba oglądanych RBC x 100).

– w grubej kropli jest to liczba pasożytów przypadających na 1 µl krwi, któ-

rą określa się licząc pasożyty oraz białe krwinki w wielu polach widzenia,

w odniesieniu do standardowej liczby 8000 białych krwinek w 1 µl krwi, wg

wzoru: liczba pasożytów x (8000/liczba policzonych białych krwinek).

Materiał do badań serologicznych

We wczesnej fazie zakażenia, przed zastosowaniem leczenia,

należy pobrać

5-10 ml krwi na skrzep w celu uzyskania surowicy. Drugą próbkę krwi należy po-

brać po 2 tygodniach. Jeśli w drugiej próbce krwi nie zostanie stwierdzony czte-

rokrotny wzrost miana przeciwciał, należy rozważyć pobranie trzeciej próbki po

4-6 tygodniach od pobrania pierwszej.



Surowica krwi. Uzyskaną surowicę krwi umieścić w lodówce w temperaturze

5°C±3°C. Jeżeli badanie będzie wykonywane w dniu przyjęcia lub dnia na-

stępnego to uzyskaną surowicę krwi należy umieścić w lodówce w temperatu-

rze 5°C±3°C. Jeżeli przewidywany termin wykonania badania jest dłuższy niż

24 godziny należy surowicę umieścić w zamrażarce. Jeżeli próbka jest trans-

portowana w stanie zamrożonym, należy natychmiast umieścić ją w tempera-

turze -20°C lub niższej według przyjętego schematu przechowywania próbek

oczekujących na badania.

Przed wykonaniem badań, próbki wyjmowane są z zamrażarki na godzinę

przed nastawieniem testu. Wszelkie powtórzenia badania lub ustalenie ostatecz-

nego miana w badaniu metodą immunofluorescencji powinno być wykonywane

w ciągu 48 godzin od momentu rozmrożenia próbki.

Po wykonaniu i zakończeniu badania próbka powinna być ponownie zamro-

żona i przechowywana przez okres zgodny z okresem przechowywania przyję-

tym w danym laboratorium.



Surowica lub plazma w ilości około 1 ml, bez hemolizy, należy pobrać ja-

łowo do szczelnie zamykanej probówki. Do 24 godzin od momentu pobra-

nia materiału, próbki można przechowywać i transportować w temperatu-

rze pokojowej (21 ± 4

C), jednak zaleca się przechowywać i transportować

w warunkach chłodni (5 ± 3

C). Jeżeli próbka będzie przechowywana powyżej

2.2. Badania serologiczne

Definicje związane z procedurą

ELISA

– metoda immunoenzymatyczna, w której jeden z elementów jest zwią-

zany chemicznie z enzymem, którego aktywność oznaczana jest w reak-

cji z substratem i odczytywana kolorymetrycznie.

– czynnik reumatoidalny – przeciwciało klasy IgM o charakterze antyim-

muno-globuliny, reagujące z kompleksem IgG-antygen.

Szara strefa

– zakres pomiarów lub wyliczonych stężeń, w którym nie jest moż-

liwe jednoznaczne określenie czy próba jest dodatnia czy ujemna. Zakres

szarej strefy jest powiązany z niepewnością wyniku i nie może być mniej-

szy niż ustalona niepewność.

Diagnostyka laboratoryjna chorób odkleszczowych

24 godzin należy ją zamrozić i transportować w warunkach uniemożliwiają-

cych rozmrożenie;



Krew pełna w ilości około 5 ml, pobrana jałowo „na skrzep”.

Próbkę należy

dostarczyć do laboratorium bezzwłocznie w przeciągu 2 h od pobrania;



Płyn mózgowo-rdzeniowy (PMR) w ilości około 1 ml, pobrany jałowo do

szczelnie zamykanej probówki. Do 24 godzin od momentu pobrania materia-

łu, próbki można przechowywać i transportować w temperaturze pokojowej

(21 ± 4

C), jednak zaleca się przechowywać je i transportować w warunkach

chłodni (5 ± 3

C ). Jeżeli próbka będzie przechowywana powyżej 24 godzin

należy ją zamrozić i transportować w warunkach uniemożliwiających roz-

mrożenie.

UWAGA:

Oznaczenia obecności swoistych przeciwciał w płynie mózgowo-

-rdzeniowym należy zawsze wykonywać równolegle z oznaczeniami w suro-

wicy pobranej w tym samym czasie. Płyn mózgowo-rdzeniowy do oznaczania

miejscowej syntezy przeciwciał w OUN nie może być zamrożony.

Algorytm postępowania diagnostycznego

Badanie przeciwciał pośrednią metodą ELISA

Badanie składa się z dwóch faz działania:

– fazy przygotowawczej;

– fazy właściwego wykonania testu

–

Faza przygotowawcza obejmuje:

ostateczną ocenę przydatności próbek do badania,

sprawdzenie zgodności oznakowania próbki do dołączonej karty badań,

sprawdzenie instrukcji badań i formularzy,

sprawdzenie wyposażenia,

przygotowanie zestawów diagnostycznych i materiałów odniesienia zgodnie

z instrukcją,

opracowanie próbki odczynnikiem eliminującym fałszywie dodatnie wyniki

oznaczeń związane z występowaniem w badanych materiałach czynnika reu-

matoidalnego (dotyczy

tylko oznaczeń IgM w surowicy/osoczu).

Schemat wykonania testu ELISA dla oznaczeń przeciwciał IgM/IgG

1. Faza przygotowawcza

2. Inkubacja rozcieńczeń badanej próbki i materiałów odniesienia z antygenem

3. Inkubacja ze znakowanym enzymem koniugatem anty-IgM

6. Odczyt spektrofotometryczny

Elementy kontroli i weryfikacji.

Wszystkie niezbędne do kontroli elementy wchodzące w skład zestawów mu-

szą być używane w trakcie każdego badania stanowiąc element nadzoru bieżą-

cego nad jakością pracy.

Uzyskane z wykorzystaniem materiałów wyniki służą

do sterowania jakością badania.

Czynnikami interferującymi w badaniu są:



Obecny w surowicach czynnik reumatoidalny,

będący przyczyną fałszywie

dodatnich wyników oznaczeń swoistych IgM i musi być usunięty. Alternatywą

jest usunięcie IgG z badanej próbki co zapobiega również zjawisku opisane-

mu w następnym punkcie poniższego fragmentu;



Swoiste dla antygenu przeciwciała IgG,

które w wysokich stężeniach mogą

blokować wiązanie swoistych IgM. Jeśli producent zestawu usuwa tylko czyn-

nik reumatoidalny interpretacja wątpliwych wyników oznaczeń IgM przy

jednoczesnym wysokim poziomie swoistych IgG jest poważnym błędem.

Wymagane jest powtórzenie badania po usunięciu IgG;



Jony żelaza

(hemoglobina) – utleniające substraty dla peroksydazy, co może

być przyczyną nieswoistych oznaczeń;



Zabarwienie próbki

(szczególnie PMR) – hemoliza uniemożliwia prawidłową

interpretację wyniku, wskazane powtórne pobranie materiału od chorego;

Pozostałe etapy stanowią właściwe wykonanie testu, a obowiązujące parame-

try wykonania zawarte są w instrukcjach do poszczególnych zestawów diagno-

stycznych.

Diagnostyka laboratoryjna chorób odkleszczowych



Płukanie – usunięcie niezwiązanych IgM



Płukanie – usunięcie niezwiązanego koniugatu

4. Reakcja enzymu ze swoistym substratem

5. Blokowanie reakcji

Diagnostyka laboratoryjna chorób odkleszczowych

Borelioza 2014 Diagnostyka laboratoryjna chorob odkleszczowych.pdf

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: