Mikrobiologia. Skrypt do ćwiczeń UW. 2015.pdf

(1309 KB) Pobierz
MIKROBIOLOGIA
SKRYPT DO ĆWICZEŃ
przygotowany przez zespół pracowników
Zakładu Genetyki Bakterii
INSTYTUT MIKROBIOLOGII
WYDZIAŁ BIOLOGII
UNIWERSYTET WARSZAWSKI
2015
SPIS TREŚCI
I. REGULAMIN PRACOWNI
II. ĆWICZENIA
Ćwiczenie 1.
Przygotowanie i jałowienie szkła i podłoży
Podstawowe techniki mikrobiologiczne
Ćwiczenie 2.
Izolowanie drobnoustrojów z różnych środowisk naturalnych
Izolowanie czystych kultur
Ćwiczenie 3.
Wzrost hodowli bakteryjnej
Określanie liczebności mikroorganizmów
Ćwiczenie 4.
Barwienie bakterii
Formy morfologiczne bakterii
Ćwiczenie 5.
Barwienie bakterii cd.
Budowa komórki bakteryjnej
Ćwiczenie 6.
Metabolizm bakterii – źródła węgla, azotu i energii
Ćwiczenie 7.
Metabolizm bakterii – procesy oddechowe i fermentacje
Ćwiczenie 8.
Koniugacja u bakterii
Ćwiczenie 9.
Analiza mikrobiologiczna wody
Oznaczanie bakterii grupy coli
Ćwiczenie 10.
Podstawowe techniki pracy z bakteriofagami
III. ADDENDUM
1. Opis kolonii bakteryjnych
2. Komora Thomy
IV. KRÓTKA CHARAKTERYSTYKA BAKTERII STOSOWANYCH NA
ĆWICZENIACH
V. SŁOWNICZEK POLSKO-ANGIELSKI
(terminy mikrobiologiczne)
VI. ZALECANA LITERATURA
4
3
9
15
19
21
23
28
33
38
43
46
50
54
56
2
I. Regulamin pracowni
1. W pracowni obowiązuje noszenie fartucha ochronnego (najlepiej białego).
2. Wszystkie odczynniki i ich roztwory, a także podłoża i hodowle mikroorganizmów muszą
być czytelnie oznakowane.
3. Na stołach laboratoryjnych mogą znajdować się wyłącznie materiały potrzebne do
wykonywania ćwiczenia.
4. Należy zachować daleko idącą ostrożność przy pracy z materiałem mikrobiologicznym, a
w szczególności:
a) stosować się do zasad pracy jałowej (zachować szczególną ostrożność przy pracy
w bezpośrednim sąsiedztwie płomienia palnika);
b) wstawiać hodowle bakteryjne w probówkach do statywów (nie wolno ich kłaść na
stole);
c) opisywać każdą posianą próbę (rodzaj posiewu, inicjały osoby wykonującej
posiew, itp.);
d) po skończeniu posiewów wyżarzać ezy, opalać głaszczki i zawsze wstawiać je do
statywów, a zużyte pipety wkładać do specjalnych pojemników.
5. W pracowni zabronione jest spożywanie posiłków, a także picie napojów.
6. Po zakończeniu pracy należy:
a) wyłączyć dopływ gazu;
b) posprzątać stół laboratoryjny;
c) niepotrzebny już sprzęt odłożyć na miejsce, pozostawić w porządku mikroskopy.
7. Niepotrzebne hodowle drobnoustrojów oraz szkło zużyte w trakcie pracy należy odłożyć do
specjalnie przygotowanych pojemników, po uprzednim usunięciu wszelkich napisów.
8. Nie wolno wynosić z pracowni żadnych hodowli bakteryjnych, preparatów i odczynników
bez pozwolenia prowadzącego zajęcia.
9. Po zakończeniu ćwiczeń należy sprawdzić, czy został wyłączony gaz oraz aparatura nie
przeznaczona do pracy ciągłej, a przed wyjściem z sali – umyć ręce.
10. W razie pojawienia się jakichkolwiek problemów należy niezwłocznie zgłosić się do
osoby prowadzącej zajęcia.
3
Ćwiczenie 1
Temat: Przygotowanie i jałowienie szkła i podłoży
Podstawowe techniki mikrobiologiczne
I. WPROWADZENIE
1. Podłoża
Obiektem badań w mikrobiologii są mikroskopijnej wielkości organizmy występujące
powszechnie we wszystkich środowiskach naturalnych. Badanie tych organizmów w naturalnych
warunkach bytowania jest jednak z wielu względów bardzo trudne, a często niemożliwe.
Poznanie morfologii, fizjologii, wymagań pokarmowych i środowiskowych drobnoustrojów jest
możliwe dzięki stworzeniu sztucznych środowisk do ich hodowli – tzw. podłoży (pożywek)
mikrobiologicznych. Umożliwiły one hodowanie drobnoustrojów w warunkach laboratoryjnych i
uzyskanie czystych kultur – tzn. hodowli stanowiących potomstwo jednego osobnika i będących
materiałem do badań mikrobiologicznych.
Podłoża mikrobiologiczne
są to mieszaniny odpowiednio dobranych składników
odżywczych, dostarczających hodowanym na nich organizmom niezbędnych pierwiastków
chemicznych oraz źródła energii. Każde podłoże musi mieć odpowiednią dla danego gatunku
wartość odżywczą, odpowiednie pH, rH i ciśnienie osmotyczne. Ważne jest również określenie,
do jakiego celu ma służyć dane podłoże (np. czy chodzi nam o uzyskanie hodowli, o
wyselekcjonowanie jakiegoś określonego gatunku, o zróżnicowanie gatunków występujących w
mieszaninie, itd.).
Zależnie od potrzeby możemy zastosować podłoże:
1.
minimalne
– zawiera tylko te składniki, które są niezbędne do wzrostu mikroorganizmu;
2.
pełne
– zapewnia optymalny wzrost danego mikroorganizmu;
3.
selekcyjne
– umożliwia wyłącznie wzrost mikroorganizmów o określonych cechach;
4.
różnicujące
– pozwala na zróżnicowanie mikroorganizmów względem określonej cechy na
podstawie morfologii kolonii;
5.
syntetyczne
– charakteryzuje się ściśle określonym składem jakościowym i ilościowym;
6.
złożone
– zawiera ekstrakty drożdżowe, autolizaty drożdżowe, peptony, ekstrakty mięsne,
itp., a więc jego skład jakościowy i ilościowy nie jest ściśle określony.
Podłoża wzbogacone
stosuje się do hodowli drobnoustrojów, które wymagają dodatkowych
substancji odżywczych, występujących w naturalnych produktach. Podłoże (np. bulion
odżywczy) wzbogaca się, dodając do niego krew, surowicę, wyciąg glebowy, mleko, żółtko jaj,
namok siana, soki warzywne, itp. Podłoża
mineralne
nie zawierają związków organicznych i
stosuje się je do hodowania różnego rodzaju mikroorganizmów autotroficznych.
2. Klasyfikacja podłoży
Klasyfikację podłoży można przeprowadzić stosując różne kryteria:
1.
skład:
(i) podłoża syntetyczne o ściśle określonym składzie chemicznym, (ii) podłoża o nie w
pełni zdefiniowanym składzie chemicznym ze względu na obecność składników pochodzenia
naturalnego;
2.
wymagania pokarmowe mikroorganizmów:
(i) podłoża minimalne, (ii) podłoża pełne;
3.
zastosowanie:
(i) różnicujące, (ii) wybiórcze, (iii) wybiórczo-różnicujące, (iv) namnażające,
(v) transportowe;
4.
konsystencję:
(i) płynne, (ii) półpłynne i (iii) stałe.
Podłoża zestala się najczęściej
agarem,
który jest uzyskiwany z krasnorostów morskich. Podłoża
zestalone można wykorzystywać w postaci słupków, skosów i na płytkach Petriego.
4
3. Zasady przygotowywania podłoży
Przygotowując podłoża należy:
1. używać szkła odpowiednio wymytego i wypłukanego;
2. przestrzegać ściśle przepisów przygotowania pożywek (odważać dokładnie składniki,
zwracać uwagę na kolejność ich dodawania i na uwodnienie soli);
3. używać tylko wody destylowanej;
4. ustawiać odpowiednie pH podłoża, pamiętając o tym, że po jałowieniu w autoklawie pH
może się obniżyć;
5. do jałowienia rozlewać podłoże do kolb do objętości nie większej niż 3/4 naczynia, aby nie
wykipiało w czasie jałowienia w autoklawie;
6. kolby zatykać korkami z waty, zabezpieczać korki przed zamoczeniem folią aluminiową i
odpowiednio podpisywać;
7. stosować możliwie najniższą temperaturę do jałowienia.
4. Sposoby sterylizacji
Jednym z koniecznych warunków, jaki muszą spełniać wszystkie podłoża, jest ich sterylność, co
oznacza, że muszą być pozbawione wszelkich organizmów – zarówno ich form wegetatywnych
jak i przetrwalnikowych, a także wirusów.
Proces sterylizacji
można przeprowadzić dwoma
sposobami:
1.
przez
zabicie
drobnoustrojów i ich form przetrwalnikowych, a także inaktywację wirusów, w
wyniku działania:
(a) wysokiej temperatury – suszarka, autoklaw, aparat Kocha;
(b) promieniowania UV,
X;
(c) związków chemicznych, np. tlenek etylenu lub propylenu;
2.
przez
usunięcie
drobnoustrojów i ich form przetrwalnikowych z danego środowiska
(filtracja).
Wybór metody sterylizacji zależy od rodzaju sterylizowanego podłoża (środowiska), a także od
wyposażenia laboratorium; należy wybrać metodę nie niszczącą podłoża, a skuteczną, możliwie
szybką i tanią. Trzeba też pamiętać, że w pracowni mikrobiologicznej sterylizujemy wszystko,
czym moglibyśmy zakazić hodowlę badanych drobnoustrojów.
Jałowienie szkła w suszarce
W suszarce jałowimy przede wszystkim szkło (odpowiednio zabezpieczone i zapakowane) i te
przedmioty, które nie ulegną zniszczeniu w tak wysokiej temperaturze. Sterylizację
przeprowadza się w 160
o
C przez 2 godziny lub rzadziej w 180
o
C przez 1 godzinę (nie wolno
przekraczać temp. 180
o
C, gdyż grozi to zwęgleniem papieru i waty). Zabite zostają wszystkie
mikroorganizmy, w tym ich formy przetrwalnikowe, i wirusy.
Jałowienie w autoklawie
Temperatura 100
o
C nie zabija form przetrwalnikowych i niektórych wirusów. Wyższą
temperaturę wrzenia wody można osiągnąć po zastosowaniu nadciśnienia. W autoklawie –
hermetycznie zamkniętym kotle – stosując nadciśnienie 1 atm, uzyskuje się atmosferę nasyconej
pary wodnej o temp. 121
o
C. W tej temperaturze wszystkie mikroorganizmy i ich przetrwalniki
zostają zabite w ciągu około 20 minut. Czas trwania sterylizacji w autoklawie zależeć będzie od
rodzaju jałowionego materiału i jego objętości. W ten sposób w autoklawie jałowi się:
a) podłoża (oprócz tych, które rozkładają się w tej temperaturze), np. bulion i agar
odżywczy,
b) wodę destylowaną, sól fizjologiczną, roztwory soli, bufory,
c) narzędzia chirurgiczne, opatrunki, itp.
5

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin